Demir (Fe) biyoyararlanımı için Caco-2 hücre biyotahlili, gıdalardan, gıda ürünlerinden, takviyelerden, yemeklerden ve hatta diyet rejimlerinden Fe biyoyararlanımını değerlendirmek için uygun maliyetli ve çok yönlü bir yaklaşımı temsil eder. İnsan çalışmalarına tamamen doğrulanmış, Fe biyoyararlanımı çalışmaları için en son teknolojiyi temsil eder.
Fe biyoyararlanımı bilgisi, gıdalardaki Fe’nin beslenme kalitesinin değerlendirilmesinde kritik öneme sahiptir. Fe biyoyararlanımının in vivo ölçümü, maliyet, verim ve Fe gıdasının izotopik etiketlenmesine özgü uyarılarla sınırlıdır. Bu nedenle, yüksek verimli ve uygun maliyetli bir yaklaşıma kritik bir ihtiyaç vardır. Caco-2 hücre biyotahlili bu ihtiyacı karşılamak için geliştirilmiştir. Fe biyoyararlanımı için Caco-2 hücre biyotahlili, Caco-2 olarak bilinen bir insan bağırsak epitel hücre hattının kültürü ile birlikte simüle edilmiş gastrik ve bağırsak sindirimini kullanır. Kako-2 hücrelerinde, Fe alımı, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile kolayca ölçülebilen bir Fe depolama proteini olan ferritinin hücre içi oluşumunu uyarır. Ferritin, Fe alımı ile orantılı olarak oluşur; Böylece, Caco-2 hücreli ferritin üretimini ölçerek, simüle edilmiş gıda sindirimlerinden enterosit içine bağırsak Fe alımı değerlendirilebilir.
Bu yaklaşımla, model gıda Fe biyoyararlanımını belirleyen temel ilk adımı çoğaltır. 1998’deki kuruluşundan bu yana, bu model yaklaşımı, insan Fe biyoyararlanımını etkilediği bilinen faktörlerle titizlikle karşılaştırılmıştır. Ayrıca, Fe biyofortifiye mahsulleri değerlendiren üç insan etkinliği çalışması ile paralel çalışmalarda uygulanmıştır. Her durumda, biyotahlil, faktörlerden, mahsullerden ve genel diyetten Fe biyoyararlanımının göreceli miktarlarını doğru bir şekilde tahmin etmiştir. Bu yazıda, Fe biyoyararlanımı için Caco-2 hücre biyotahlilini yapmak için gerekli olan in vitro sindirim süreci ve hücre ferritin ELISA ile birlikte Caco-2 hücre kültürü hakkında ayrıntılı yöntemler sunulmaktadır.
Fe biyoyararlanımı için Caco-2 hücre biyotestinin araştırma ihtiyacını ve yararını tam olarak anlamak için, önce bu modelin ortaya çıkmasından önce yürürlükte olan yaklaşımları anlamak gerekir. Bir gıdadan veya yemekten in vivo Fe biyoyararlanımının ölçülmesi, özellikle gıda kombinasyonlarının bir öğünde veya diyette değerlendirilmesi gerektiğinde zorlu bir iştir. İzotopik etiketleme, son 50 yılda Fe biyoyararlanımının ölçümü için en yaygın yaklaşım olmuştur1. İzotopik etiketleme, tek öğünlü ve çok öğünlü çalışmalar için kullanılır ve uzun süreli çalışmalar için pratik değildir. 57Fe ve 58Fe gibi kararlı Fe izotopları en yaygın kullanılanlardır; Bununla birlikte, 59Fe gibi radyoizotoplarla, tüm vücut sayımı2 kullanılarak çalışmalar yapılmıştır. Bitkisel gıdalar için, izotopik etiketleme dışsal veya içsel etiketleme yoluyla yapılmıştır. Dışsal etiketleme için, yiyeceğe veya yemeğe bilinen miktarda izotop eklenir. Gıda daha sonra karıştırılır ve tüketimden önce protokole 15-30 dakikalık bir denge süresi dahil edilir. Hidroponik kültür – izotopu, büyürken ve gelişirken bitkiye dahil etmek için besin çözeltisine eklemek – bitki besinlerinin içsel etiketlenmesi için gereklidir. Her yaklaşımın artıları ve eksileri aşağıda tartışılmaktadır.
Dışsal izotopik etiketleme
1970’lerin başından ortalarına kadar, insan Fe emilimi, gıdalarda Fe’nin dışsal etiketlenmesiyle incelendi; burada gıda veya öğündeki bilinen Fe miktarına bilinen miktarda izotop eklendi, karıştırıldı ve ölçümlerden önce 15-30 dakika boyunca dengelendi. İntrinsik Fe’nin% 1 ila% 100’ü arasında değişen, ancak en yaygın olarak% 7-% 30 aralığında olan çeşitli miktarlarda dışsal izotoplar kullanılmıştır3. Dışsal etiketleme, dışsal Fe izotopunun, gıda veya yemeğin içsel Fe’si ile tamamen dengelendiği varsayımına dayanır. Dışsal izotop absorpsiyonu daha sonra ölçülür ve dışsal izotopun her bir atomu, belirli sayıda içsel Fe atomunu temsil edecek şekilde hesaplanır. Bu hesaplama göreceli azı dişi miktarlarına dayanmaktadır. 1983 yılında, tekniğin çoklu validasyon çalışmaları bir derleme makalesinde özetlenmiştir4. Tekniğin doğrulanması, ekstrinsik izotopik etiketin emilim yüzdesini aynı anda içsel izotopik etiketin emilim yüzdesi ile karşılaştırarak yapıldı. Bu nedenle, dışsal ve içsel absorpsiyonun 1’e yakın bir oranı, her bir Fe havuzunun eşit olarak emildiğini göstermektedir. O zamanlar, 1’e yakın bir oranın dışsal izotopun yiyecek veya öğünün içsel Fe’si ile dengelenmesini temsil ettiği düşünülüyordu. Dışsal ve intrinsik Fe absorpsiyon oranları ortalama değerler 0.40 ila 1.62 arasında değişmekte olup, 63 karşılaştırmada ortalama (±SD) oranı 1.08 ± 0.14 olarak belirlenmiştir. Bu derlemede özetlenen tüm çalışmalarda, hiçbirinin dışsal etiketin içsel Fe ile dengesini doğrudan test etmediğini belirtmek önemlidir. Özetle, incelemenin yazarları aşağıdaki sonuca varmışlardır:
“Dışsal etiket tekniğinin, belirli deneysel koşullar altında birçok gıda için geçerli olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, bu yöntem henüz her türlü gıda ile ilgili olarak kanıtlanmış olarak kabul edilemez. Dışsal etiket yöntemi, çözünmeyen demir formları içeren bir diyetten demir emilimini izlemek için uygun değildir. Bu tekniğin geçerliliği, dışsal etiketin tüm endojen nonheme gıda demiri ile tamamen değiştiği temel varsayımına dayanır. Şu anda, farklı nonheme demir formlarının dışsal bir etiketle nasıl tamamen etiketlendiği bilinmemektedir. Bu, demir inhibitörlerinin dışsal etiketi gıdalardaki bazı nonheme demir formlarından farklı şekilde etkileyebileceğini öne süren çalışmalar ışığında önemlidir. Tam bir izotopik değişimi bozabilecek gıda faktörleri üzerine yapılan araştırmalar yetersizdir. Bu nedenle, dışsal etiket araştırmalarından elde edilen biyoyararlanım verilerinin yorumlanması, gıda veya diyette bulunabilecek değişim inhibitörlerinin dikkate alınmasını gerektirir. “
1983’ten bu yana, Fe 3,5’in dışsal etiketlemesinin doğruluğunu değerlendiren sadece iki çalışma yayınlanmıştır. Her iki çalışmada da, dışsal izotopik bir etiketin dengesi, bu çalışmalarda temel gıda bitkileri olan gıdaların içsel Fe’si ile doğrudan karşılaştırılmıştır. Beyaz, kırmızı ve siyah fasulye çeşitleri, mercimek ve mısır ile birlikte test edildi. Yerleşik in vitro sindirim tekniklerini ve Fe çözünürlüğü ve çökeltme ölçümünü kullanarak, her iki çalışma da dışsal izotopik etiketlemenin tutarlı bir şekilde tam denge ile sonuçlanmadığını, bazı fasulye çeşitleri için yanlış dengenin dışsal izotop miktarına ve tohum kabuğu rengine bağlı olarak çok yüksek olabileceğine dair kanıtlarla göstermiştir3. 1983 tarihli gözden geçirme makalesinin sonuçlarına rağmen, fasulyenin dışsal etiketleme çalışmaları 6,7,8,9,10,11,12 devam etmiştir. Bu çalışmaların hiçbiri, dışsal etiketin içsel Fe ile dengesini test etmeyi içermedi.
İçsel etiketleme
Fe biyoyararlanımının değerlendirilmesi için bitki gıdalarının içsel olarak etiketlenmesi, dışsal etiketlemede dengenin doğruluk sorunlarını ortadan kaldırır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, hidroponik kültür için sera alanı gereksinimi nedeniyle büyük miktarda malzeme veremez. Hidroponik kültür emek yoğundur, yüksek miktarda pahalı kararlı izotop gerektirir ve genellikle verim ve tohum Fe konsantrasyonu açısından farklı bitki büyümesine neden olur. Maliyet nedeniyle, içsel etiketleme yalnızca Fe alımının altında yatan mekanizmaları veya gıdalardan Fe alımını etkileyen faktörleri anlamayı amaçlayan küçük ölçekli çalışmalar için uygundur. 1-2 kg temel gıda mahsulünün üretimi, izotop ve hidroponik yaklaşım13,14’e bağlı olarak, yalnızca malzemeler için yaklaşık 20.000-30.000 $ ‘a mal olmaktadır.
İzotopik etiketleme ile ilgili zorluklar göz önüne alındığında, araştırmacılar in vitro yaklaşımlar geliştirmeye çalıştılar. Erken yöntemler, simüle edilmiş mide ve bağırsak gıdalarını kullandı ve biyoyararlanımın bir tahmini olarak Fe çözünürlüğü veya Fe diyalizbilitesinin ölçülmesi ile birleşti15. Bu tür çalışmalar hızlı bir şekilde, Fe diyalize edilebilirliğinin, Fe’nin çözünür olabileceği, bileşiklere sıkıca bağlanabileceği ve bu nedenle değiştirilemediği ve biyoyararlanımın abartılmasına yol açabileceği için tutarlı bir biyoyararlanım ölçüsü olmadığını bulmuştur. Bu sorunları ele almak için, bir insan bağırsak hücresi hattını kullanma metodolojisi gelişti, böylece canlı bir bileşen eklendi ve Fe alımının ölçülmesini sağladı16. İnsan bağırsak hücreleri – Kako-2 hücreleri – bir insan kolon karsinomundan kaynaklanmıştır ve besin alım çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu hücre çizgisi, kültürde, hücreler ince bağırsağın fırça sınır hücrelerine benzer şekilde işlev gören enterositlere farklılaştığı için yararlıdır. Çalışmalar, Kako-2 hücrelerinin uygun taşıyıcıları ve Fe alımını etkileyen faktörlere yanıt verdiğini göstermiştir17,18.
Caco-2 hücrelerinde Fe alımını ölçmek için radyoizotopları kullanan ilk çalışmalar, Caco-2 hücresi ferritin oluşumuna dayanarak Fe alımını ölçmek için rafine edildi. Kako-2 hücreli ferritin ölçümü, numune verimini arttırdı ve radyoizotop işleme ve dışsal Fe’nin içsel Fe19,20 ile dengelenmesi sorunlarını reddetti. Ferritin oluşumu yoluyla Fe alımının ölçülmesi, araştırmacıların karmaşık yemekler de dahil olmak üzere çok çeşitli yiyecekleri incelemelerini sağladı21. Böylece, simüle edilmiş (in vitro) sindirim, Caco-2 hücresi Fe alımı ile birleştiğinde, gıdalardan Fe alımının daha iyi bir fizyolojik değerlendirmesini sağlamıştır. Bu modelin öncelikle Fe biyoyararlanımındaki göreceli farklılıkları belirlediğine dikkat etmek önemlidir. Birçok yararlı hücre hattı gibi, Caco-2 hücreleri de duyarlılıkta değişkenlik göstermiştir, ancak gıdalar arasındaki Fe alımında tutarlı göreceli farklılıklar sağlamıştır. Uygun teknik ve detaylara dikkat etmek, Caco-2 hücrelerinde tutarlı hücre ferritin oluşum yanıtını artırabilir.
In vitro sindirim / Caco-2 hücre modeli, Caco-2 hücre biyotahlili olarak da bilinir. Bu tahlil, insan ve hayvan çalışmaları ile doğrudan karşılaştırılarak tamamen doğrulanmıştır22. Biyotahlilin insan etkinliği denemeleriyle doğrudan paralel karşılaştırılmasına ek olarak, bu modelin Fe alımında 18,19,23 insanlarınkine nitel olarak benzer bir yanıt sergilediği gösterilmiştir. Bu nedenle, in vitro bir yaklaşım olarak, Caco-2 hücre biyotahlili, gıdalardan Fe beslenmesini değerlendirmek için bir tarama aracı olarak yüksek güvenilirliği garanti eder. Çok sayıda gıda ve gıda ürününe yaygın olarak uygulanmıştır 21,24,25,26,27,28.
1998’deki kuruluşundan bu yana, Caco-2 hücre biyotahlili, bağırsak Fe alımını etkileyen faktörlerin belirlenmesine yardımcı olduğu için Fe beslenme alanını geliştirmiştir. Bunu yaparken, bu model daha kesin ve daha az maliyetli insan çalışmaları için araştırma hedefleri geliştirmiş ve rafine etmiştir. Modelin kullanılmasının bazı insan denemelerine olan ihtiyacı ortadan kaldırdığı da iddia edilebilir.
Özetle, Fe’nin bir gıdadan veya yemekten göreceli olarak verilmesi, Caco-2 hücre biyotahlili ile ölçülebilir. Test yemeğindeki Fe miktarından bağımsız olarak, biyotahlil, enterosit içine alınan göreceli Fe miktarını tanımlar – emilim sürecinin ilk adımı. Bu, Fe biyoyararlanımını tanımlamadaki en önemli adımdır, çünkü çoğu zaman amaç, bir gıdadaki Fe’nin beslenme kalitesini iyileştirmek veya en azından izlemek amacıyla ölçmektir. Demir durumunun emilim ile düzenlendiği ve dolayısıyla Fe alımının Fe eksikliği olan bireylerde beslenme ihtiyaçlarını karşılamak için yukarı regüle edildiği göz önüne alındığında, modelin standart koşulları, hücreler tarafından Fe alımının maksimum olacağı şekilde tasarlanmıştır. Bu şekilde, biyotahlil, gıdanın Fe’yi sağlama potansiyelinin gerçek bir ölçüsünü sağlar.
Kuruluşundan bu yana, Caco-2 hücre biyotahlili için bu yöntemi tanımlayan çok sayıda çalışma yayınlanmıştır. Temel koşullar, 1998’deki ilk yayından bu yana nispeten değişmeden kalmıştır18. Bununla birlikte, son 20 yılda, biyotahlilin yanıtında benzeri görülmemiş bir tutarlılık sağlamak için çok sayıda teknik ayrıntı rafine edilmiş ve standartlaştırılmıştır. Hücre kültürüne ve in vitro sindirim koşullarına dikkatli ve hassas bir şekilde bağ…
The authors have nothing to disclose.
Yazar, Yongpei Chang ve Mary Bodis’in teknik çabaları için derinden minnettardır. Bu modelin beslenme alanında son derece başarılı bir şekilde uygulanması, uzmanlıklarının ve detaylara gösterilen özenin doğrudan bir sonucudur. Bu modelin geliştirilmesi tamamen Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı, Tarımsal Araştırma Servisi tarafından finanse edildi.
0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
collagen | Corning | 354236 | |
dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
large column | VWR International | KT420400-1530 | |
Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |