食品鉄バイオアベイラビリティ測定のためのCaco-2細胞バイオアッセイ
Summary
鉄(Fe)バイオアベイラビリティに関するCaco-2細胞バイオアッセイは、食品、食品、サプリメント、食事、さらには食事療法からのFeバイオアベイラビリティを評価するための費用効果が高く汎用性の高いアプローチです。ヒトの研究に対して徹底的に検証されており、Feバイオアベイラビリティの研究のための最先端を表しています。
Abstract
Feバイオアベイラビリティに関する知識は、食品中のFeの栄養価を評価するために重要です。Feバイオアベイラビリティの in vivo 測定は、コスト、スループット、および食品Feの同位体標識に固有の警告によって制限されます。したがって、高スループットで費用対効果の高いアプローチに対する重要なニーズが存在します。Caco-2細胞バイオアッセイは、このニーズを満たすために開発されました。FeバイオアベイラビリティのためのCaco-2細胞バイオアッセイは、Caco-2として知られるヒト腸管上皮細胞株の培養と組み合わせたシミュレートされた胃および腸の消化を利用します。Caco-2細胞では、Feの取り込みは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって容易に測定されるFe貯蔵タンパク質であるフェリチンの細胞内形成を刺激します。フェリチンはFeの取り込みに比例して形成されます。したがって、Caco-2細胞フェリチン産生を測定することにより、模擬食品消化物から腸細胞への腸内Fe取り込みを評価することができます。
このアプローチにより、モデルは食品Feのバイオアベイラビリティを決定する重要な初期ステップを再現します。1998年の開始以来、このモデルアプローチは、ヒトFeバイオアベイラビリティに影響を与えることが知られている要因と厳密に比較されてきました。さらに、それは並行研究に適用されており、Fe生物強化作物を評価する3つの人間有効性研究があります。すべての場合において、バイオアッセイは、因子、作物、および全体的な食事からFeバイオアベイラビリティの相対量を正しく予測しました。この論文は、FeバイオアベイラビリティのためのCaco-2細胞バイオアッセイを実施するために必要な in vitro 消化プロセスおよび細胞フェリチンELISAと組み合わせたCaco-2細胞培養の詳細な方法を提供します。
Introduction
FeバイオアベイラビリティのためのCaco-2細胞バイオアッセイの研究の必要性と利点を完全に理解するには、まず、このモデルの出現前に実施されていたアプローチを理解する必要があります。in vivoでの食品または食事からのFeバイオアベイラビリティの測定は、特に食事または食事で食品の組み合わせを評価する必要がある場合、困難な作業です。同位体標識は、過去50年間にわたってFeバイオアベイラビリティを測定するための最も一般的なアプローチでした1。同位体標識は、単食および複数食の研究に使用され、長期の研究には実用的ではありません。57Feや58FeなどのFeの安定同位体が最も一般的に使用されています。しかし、59Feなどの放射性同位元素では、全身計数2を利用した研究が行われています。植物性食品の場合、同位体標識は外因性または内因性標識によって行われています。外因性標識のために、既知量の同位体が食品または食事に添加される。次に、食品を混合し、消費前に15〜30分の平衡期間をプロトコルに組み込みます。水耕栽培培養(同位体を養液に添加して、成長および発達する間に植物に取り込む)は、植物性食品の固有の表示に必要です。各アプローチの長所と短所については、以下で説明します。
外因性同位体標識
1970年代初頭から中期にかけて、食品中のFeの外因性標識によってヒトのFe吸収が研究され、食品または食事中の既知の量のFeに既知量の同位体が添加され、混合され、測定前に15〜30分間平衡化されました。様々な量の外因性同位体が使用されており、真性Feの1%から100%の範囲であるが、最も一般的には7%〜30%3の範囲である。外因性標識は、外因性Fe同位体が食品または食事の内因性Feと完全に平衡化されるという仮定に基づいています。次に、外因性同位体吸収が測定され、外因性同位体の各原子が計算されて、所定の数の固有Fe原子を表します。この計算は、相対モル量に基づいています。1983年に、この手法の複数の検証研究がレビュー論文4にまとめられました。この手法の検証は、外因性同位体標識の吸収率と内因性同位体標識の吸収率を同時に比較することによって行われました。したがって、外因性吸収と内因性吸収の比が1に近いことは、Feの各プールが等しく吸収されたことを示唆している。当時、1に近い比率は、外因性同位体と食品または食事の固有Feとの平衡を表すとも考えられていました。外因性Fe吸収と内因性Fe吸収の比は平均値0.40から1.62の範囲であり、63の比較で平均(±SD)比は1.08±0.14であった。本レビューで要約したすべての研究において、外因性標識と内因性Feとの平衡を直接テストしたものはなかったことに注意することが重要です。要約すると、レビューの著者は次のように結論付けました。
「外因性タグ技術は、特定の実験条件下でいくつかの食品に有効であることが証明されています。しかし、この方法は、すべての種類の食品に関してまだ証明されているとは言えません。外因性タグ法は、不溶性の鉄を含む食事からの鉄吸収を監視するのには適していません。この技術の有効性は、外因性タグがすべての内因性の非ヘム食品鉄と完全に交換するという基本的な仮定に依存しています。現在のところ、異なる形態の非ヘム鉄が外因性タグによってどの程度完全に標識されているかは知られていない。これは、鉄阻害剤が食品中のある種の非ヘム鉄とは異なる方法で外因性タグに影響を与える可能性があることを示唆している研究に照らして重要です。完全な同位体交換を損なう可能性のある食物因子に関する研究は乏しい。したがって、外因性タグ研究からのバイオアベイラビリティデータの解釈には、食品または食事に存在する可能性のある交換阻害剤を考慮する必要があります。」
1983年以来、Fe 3,5の外因性標識の精度を評価した2つの研究のみが発表されています。これらの両方の研究において、外因性同位体標識の平衡化は、これらの研究では主食作物であった食品の固有のFeと直接比較されました。白、赤、黒豆の品種が、レンズ豆とトウモロコシとともにテストされました。確立されたin vitro消化技術とFeの溶解度と沈殿の測定を使用して、両方の研究は、外因性同位体標識が一貫して完全な平衡化をもたらさないことを示し、一部の豆品種では、外因性同位体の量と種皮の色に応じて不均衡が非常に高くなる可能性があるという証拠があります3。1983年のレビュー論文の結論にもかかわらず、豆の外因性標識研究は継続された6,7,8,9,10,11,12。これらの研究のいずれも、外因性標識と内因性Feとの平衡化のテストは含まれていなかった。
本質的ラベリング
Feバイオアベイラビリティの評価のための植物性食品の固有の標識は、外因性標識における平衡化の精度の問題を排除します。しかしながら、このアプローチは、水耕栽培のための温室スペースを必要とするため、大量の材料を生み出すことができない。水耕栽培は労働集約的であり、大量の高価な安定同位体を必要とし、そしてしばしば収量および種子Fe濃度の点で異なる植物の成長をもたらす。コストがかかるため、内因性標識は、Feの取り込みの根底にあるメカニズムや食品からのFeの取り込みに影響を与える要因を理解することを目的とした小規模な研究にのみ適しています。主食作物の1〜2 kgの生産には、同位体と水耕栽培のアプローチにもよりますが、材料だけで約20,000ドルから30,000ドルの費用がかかります13,14。
同位体標識に関連する課題を考慮して、研究者はin vitroアプローチの開発を目指しました。初期の方法は、生物学的利用能の推定値としてFe溶解度またはFe透析可能性の測定と相まって、シミュレートされた胃および腸の食物を利用しました15。このような研究では、Feは可溶性であり、化合物に強固に結合しているため、交換不可能であり、バイオアベイラビリティの過大評価につながる可能性があるため、Fe透析可能性はバイオアベイラビリティの一貫した尺度ではないことがすぐにわかりました。これらの課題に対処するために、ヒト腸管細胞株を利用する方法論が進化し、それによって生体成分が追加され、Fe取り込み16の測定が可能になりました。ヒト腸細胞であるCaco-2細胞は、ヒト結腸癌に由来し、栄養摂取研究に広く使用されています。この細胞株は、培養において、細胞が小腸のブラシ境界細胞と同様に機能する腸細胞に分化するので有用である。研究によると、Caco-2細胞は、Feの取り込みに影響を与える因子に対して適切なトランスポーターと応答を示します17,18。
Caco-2細胞におけるFe取り込みを測定するために放射性同位元素を利用した最初の研究は、Caco-2細胞のフェリチン形成に基づいてFe取り込みを測定するように改良された。Caco-2細胞フェリチン測定は、サンプルスループットを向上させ、放射性同位元素の取り扱いと外因性Feと内因性Fe19,20の平衡化の問題を打ち消しました。フェリチン形成によるFe取り込みの測定により、研究者は複雑な食事を含む幅広い食品を研究することができました21。したがって、Caco-2細胞のFe取り込みと組み合わせたシミュレートされた(in vitro)消化は、食品からのFe取り込みのより良い生理学的評価を提供しました。このモデルは主にFeバイオアベイラビリティの相対的な違いを決定することに注意することが重要です。多くの有用な細胞株と同様に、Caco-2細胞も応答性にばらつきを示していますが、食品間のFe取り込みに一貫した相対的な違いを維持しています。適切な技術と細部への注意深い注意は、Caco-2細胞における一貫した細胞フェリチン形成応答を改善することができる。
インビトロ消化/Caco-2細胞モデルは、Caco-2細胞バイオアッセイとしても知られています。このアッセイは、ヒトおよび動物の研究との直接比較によって徹底的に検証されています22。バイオアッセイとヒト有効性試験との直接並行比較に加えて、このモデルは、Fe取り込みにおいてヒトのそれと質的に類似した応答を示すことが示されている18,19,23。したがって、in vitroアプローチとして、Caco-2細胞バイオアッセイは、食品からのFe栄養を評価するためのスクリーニングツールとして高い信頼性を保証します。それは多くの食品および食品に広く適用されている21、24、25、26、27、28。
1998年の開始以来、Caco-2細胞バイオアッセイは、腸のFe摂取に影響を与える要因の特定に役立ったため、Fe栄養の分野を進歩させてきました。そうすることで、このモデルは、より決定的で費用のかからない人間の研究のための研究目標を開発し、洗練させました。また、モデルの使用は、いくつかの人間の試験の必要性を否定すると主張することもできます。
要約すると、食品または食事からのFeの相対送達は、Caco−2細胞バイオアッセイを用いて測定することができる。試験食中のFeの量に関係なく、バイオアッセイは、腸細胞に取り込まれるFeの相対量、つまり吸収プロセスの最初のステップを定義します。これは、Feバイオアベイラビリティを定義する上で最も重要なステップであり、ほとんどの場合、目標は食品中のFeの栄養価を改善するか、少なくとも監視する目的で測定することです。鉄の状態は吸収によって調節され、したがってFeの取り込みは栄養ニーズを満たすためにFe欠乏個体でアップレギュレーションされることを考えると、モデルの標準条件は、細胞によるFeの取り込みが最大になるように設計されている。このようにして、バイオアッセイは、Feを送達する食品の可能性の真の尺度を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
その開始以来、Caco-2細胞バイオアッセイのためのこの方法を説明する多数の研究が発表されてきた。基本的な条件は、1998年の最初の発行以来比較的変わっていません18。しかし、過去20年間にわたり、バイオアッセイの応答に前例のない一貫性をもたらすために、多くの技術的詳細が洗練され、標準化されてきました。細胞培養と in vitro 消化条件への慎重かつ正確な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、Yongpei ChangとMary Bodisの技術的な努力に深く感謝しています。栄養学の分野でのこのモデルの非常に成功した適用は、彼らの専門知識と細部への注意の直接の結果です。このモデルの開発は、米国農務省農業研究サービスによって完全に資金提供されました。
Materials
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
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