Le bioessai sur cellules Caco-2 pour la mesure de la biodisponibilité du fer alimentaire
Summary
Le bioessai sur cellules Caco-2 pour la biodisponibilité du fer (Fe) représente une approche rentable et polyvalente pour évaluer la biodisponibilité du Fe dans les aliments, les produits alimentaires, les suppléments, les repas et même les régimes alimentaires. Rigoureusement validé par les études humaines, il représente l’état de l’art pour les études de biodisponibilité du Fe.
Abstract
La connaissance de la biodisponibilité du Fe est essentielle à l’évaluation de la qualité nutritionnelle du Fe dans les aliments. La mesure in vivo de la biodisponibilité du Fe est limitée par le coût, le débit et les mises en garde inhérentes au marquage isotopique du Fe alimentaire. Il existe donc un besoin critique d’une approche à haut débit et rentable. Le bioessai sur cellules Caco-2 a été développé pour répondre à ce besoin. Le bioessai sur les cellules Caco-2 pour la biodisponibilité du Fe utilise une digestion gastrique et intestinale simulée couplée à la culture d’une lignée cellulaire épithéliale intestinale humaine connue sous le nom de Caco-2. Dans les cellules Caco-2, l’absorption de Fe stimule la formation intracellulaire de ferritine, une protéine de stockage Fe facilement mesurée par dosage immuno-enzymatique (ELISA). La ferritine se forme proportionnellement à l’absorption de Fe; ainsi, en mesurant la production de ferritine cellulaire Caco-2, on peut évaluer l’absorption intestinale de Fe à partir de digestions alimentaires simulées dans l’entérocyte.
Grâce à cette approche, le modèle reproduit l’étape initiale clé qui détermine la biodisponibilité du Fe alimentaire. Depuis sa création en 1998, cette approche de modèle a été rigoureusement comparée à des facteurs connus pour influencer la biodisponibilité du Fe humain. De plus, il a été appliqué dans des études parallèles, avec trois études d’efficacité humaine évaluant les cultures biofortifiées en Fe. Dans tous les cas, l’essai biologique a correctement prédit les quantités relatives de biodisponibilité du Fe à partir des facteurs, des cultures et de l’alimentation globale. Cet article fournit des méthodes détaillées sur la culture cellulaire Caco-2 couplée au processus de digestion in vitro et ELISA de ferritine cellulaire nécessaire pour effectuer le bioessai biologique sur cellules Caco-2 pour la biodisponibilité du Fe.
Introduction
Pour bien comprendre le besoin et les avantages de recherche de l’essai biologique sur cellules Caco-2 pour la biodisponibilité du Fe, il faut d’abord comprendre les approches qui étaient en place avant l’avènement de ce modèle. La mesure de la biodisponibilité du Fe à partir d’un aliment ou d’un repas in vivo est une tâche difficile, en particulier lorsque des combinaisons d’aliments doivent être évaluées dans un repas ou un régime. Le marquage isotopique a été l’approche la plus courante pour mesurer la biodisponibilité du Fe au cours des 50 dernières années1. Le marquage isotopique est utilisé pour les études à repas unique et à repas multiples et n’est pas pratique pour les études à long terme. Les isotopes stables du Fe tels que 57Fe et 58Fe sont les plus couramment utilisés; cependant, des études ont été menées avec des radio-isotopes tels que le 59Fe, en utilisant le comptage du corps entier2. Pour les aliments végétaux, l’étiquetage isotopique a été effectué via un étiquetage extrinsèque ou intrinsèque. Pour l’étiquetage extrinsèque, une quantité connue d’isotope est ajoutée à l’aliment ou au repas. La nourriture est ensuite mélangée et une période d’équilibration de 15 à 30 minutes est incorporée dans le protocole avant la consommation. La culture hydroponique, c’est-à-dire l’ajout de l’isotope à la solution nutritive pour l’incorporer dans la plante pendant sa croissance et son développement, est nécessaire pour l’étiquetage intrinsèque des aliments végétaux. Les avantages et les inconvénients de chaque approche sont discutés ci-dessous.
Marquage isotopique extrinsèque
Du début au milieu des années 1970, l’absorption humaine du Fe a été étudiée par marquage extrinsèque du Fe dans les aliments, dans lequel une quantité connue d’isotope est ajoutée à la quantité connue de Fe dans l’aliment ou le repas, mélangée et équilibrée pendant 15 à 30 minutes avant les mesures. Diverses quantités d’isotopes extrinsèques ont été utilisées, allant de 1 % à 100 % du Fe intrinsèque, mais le plus souvent entre 7 % et 30 %3. L’étiquetage extrinsèque est basé sur l’hypothèse que l’isotope Fe extrinsèque est complètement équilibré avec le Fe intrinsèque de l’aliment ou du repas. L’absorption isotopique extrinsèque est ensuite mesurée, et chaque atome de l’isotope extrinsèque est calculé pour représenter un nombre donné d’atomes intrinsèques de Fe. Ce calcul est basé sur les quantités molaires relatives. En 1983, de multiples études de validation de la technique ont été résumées dans un document de synthèse4. La validation de la technique a été effectuée en comparant simultanément le pourcentage d’absorption de l’étiquette isotopique extrinsèque au pourcentage d’absorption d’une étiquette isotopique intrinsèque. Ainsi, un rapport de l’absorption extrinsèque à l’absorption intrinsèque proche de 1 suggère que chaque pool de Fe a été absorbé de manière égale. À l’époque, un rapport proche de 1 était également considéré comme représentant l’équilibre de l’isotope extrinsèque avec le Fe intrinsèque de l’aliment ou du repas. Les rapports d’absorption extrinsèque / intrinsèque du Fe variaient de valeurs moyennes de 0,40 à 1,62, avec un rapport moyen (±ET) de 1,08 ± 0,14 dans 63 comparaisons. Il est important de noter que, dans toutes les études résumées dans cette revue, aucune n’a testé directement l’équilibre de l’étiquette extrinsèque avec le Fe intrinsèque. En résumé, les auteurs de la revue ont conclu ce qui suit :
« La technique de l’étiquette extrinsèque s’est avérée valable pour plusieurs aliments dans certaines conditions expérimentales. Mais, cette méthode ne peut pas encore être considérée comme prouvée en ce qui concerne tous les types d’aliments. La méthode de l’étiquette extrinsèque n’est pas appropriée pour surveiller l’absorption du fer d’un régime alimentaire contenant des formes insolubles de fer. La validité de cette technique repose sur l’hypothèse de base que l’étiquette extrinsèque échange complètement avec tout le fer alimentaire endogène non hémique. À l’heure actuelle, on ne sait pas à quel point les différentes formes de fer non hémique sont étiquetées par une étiquette extrinsèque. Ceci est important à la lumière des études qui ont suggéré que les inhibiteurs de fer peuvent affecter l’étiquette extrinsèque différemment de certaines formes de fer non hémique dans les aliments. Les recherches sur les facteurs alimentaires qui peuvent nuire à un échange isotopique complet sont rares. Ainsi, l’interprétation des données de biodisponibilité issues de la recherche sur les marqueurs extrinsèques nécessite la prise en compte des inhibiteurs de l’échange qui peuvent être présents dans l’aliment ou le régime alimentaire.
Depuis 1983, seules deux études ont été publiées évaluant la précision du marquage extrinsèque du Fe 3,5. Dans ces deux études, l’équilibre d’une étiquette isotopique extrinsèque a été directement comparé au Fe intrinsèque des aliments, qui, dans ces études, étaient des cultures vivrières de base. Des variétés de haricots blancs, rouges et noirs ont été testées, ainsi que des lentilles et du maïs. En utilisant des techniques de digestion in vitro établies et la mesure de la solubilité et de la précipitation du Fe, les deux études ont démontré que le marquage isotopique extrinsèque n’aboutit pas systématiquement à un équilibre complet, avec des preuves que, pour certaines variétés de haricots, le déséquilibre peut être très élevé en fonction de la quantité d’isotope extrinsèque et de la couleur du tégument3. Malgré les conclusions du document de synthèse de 1983, les études d’étiquetage extrinsèque des haricots se sont poursuivies 6,7,8,9,10,11,12. Aucune de ces études n’incluait le test de l’équilibre de l’étiquette extrinsèque avec le Fe intrinsèque.
Étiquetage intrinsèque
L’étiquetage intrinsèque des aliments végétaux pour l’évaluation de la biodisponibilité du Fe élimine les problèmes de précision de l’équilibre dans l’étiquetage extrinsèque. Cependant, cette approche ne peut pas produire de grandes quantités de matériel en raison de l’exigence d’espace de serre pour la culture hydroponique. La culture hydroponique exige beaucoup de main-d’œuvre, nécessite une grande quantité d’isotopes stables coûteux et entraîne souvent une croissance des plantes différente en termes de rendement et de concentration de Fe des graines. En raison de son coût, l’étiquetage intrinsèque ne convient que pour les études à petite échelle visant à comprendre les mécanismes sous-jacents à l’absorption du Fe ou les facteurs influençant l’absorption du Fe par les aliments. La production de 1 à 2 kg d’une culture vivrière de base coûte environ 20 000 à 30 000 dollars pour les matériaux seuls, selon l’approche isotopique et hydroponique13,14.
Compte tenu des défis associés au marquage isotopique, les chercheurs ont cherché à développer des approches in vitro. Les premières méthodes utilisaient des aliments gastriques et intestinaux simulés, couplés à la mesure de la solubilité du Fe ou de la dialysabilité du Fe comme estimation de la biodisponibilité15. De telles études ont rapidement révélé que la dialysabilité du Fe n’était pas une mesure cohérente de la biodisponibilité, car le Fe peut être soluble, étroitement lié aux composés et, par conséquent, non échangeable, ce qui conduit à une surestimation de la biodisponibilité. Pour résoudre ces problèmes, la méthodologie d’utilisation d’une lignée cellulaire intestinale humaine a évolué, ajoutant ainsi une composante vivante et permettant de mesurer l’absorption du Fe16. Les cellules intestinales humaines – cellules Caco-2 – proviennent d’un carcinome du côlon humain et ont été largement utilisées dans les études sur l’absorption des nutriments. Cette lignée cellulaire est utile car, en culture, les cellules se différencient en entérocytes qui fonctionnent de manière similaire aux cellules de bordure de brosse de l’intestin grêle. Des études ont montré que les cellules Caco-2 présentent les transporteurs appropriés et la réponse aux facteurs qui influencent l’absorption de Fe17,18.
Les études initiales, utilisant des radio-isotopes pour mesurer l’absorption de Fe dans les cellules Caco-2, ont été affinées pour mesurer l’absorption de Fe en fonction de la formation de ferritine des cellules Caco-2. La mesure de la ferritine cellulaire Caco-2 a amélioré le débit de l’échantillon et éliminé les problèmes de manipulation des radio-isotopes et d’équilibration du Fe extrinsèque avec le Feintrinsèque 19,20. La mesure de l’absorption de Fe par la formation de ferritine a permis aux chercheurs d’étudier un large éventail d’aliments, y compris des repas complexes21. Ainsi, la digestion simulée (in vitro) couplée à l’absorption de Fe par les cellules Caco-2 a fourni une meilleure évaluation physiologique de l’absorption de Fe par les aliments. Il est important de noter que ce modèle détermine principalement les différences relatives dans la biodisponibilité du Fe. Comme beaucoup de lignées cellulaires utiles, les cellules Caco-2 ont également montré une variabilité dans la réactivité, mais ont maintenu des différences relatives constantes dans l’absorption de Fe entre les aliments. Une technique appropriée et une attention particulière aux détails peuvent améliorer la réponse constante de la formation de ferritine cellulaire dans les cellules Caco-2.
Le modèle de digestion in vitro/cellule Caco-2 est également connu sous le nom de bioessai sur cellules Caco-2. Ce test a été validé de manière approfondie par comparaison directe avec des études humaines et animales22. En plus de la comparaison parallèle directe des essais biologiques aux essais d’efficacité chez l’homme, il a été démontré que ce modèle présente une réponse qualitativement similaire à celle des humains18,19,23 dans l’absorption du Fe. Par conséquent, en tant qu’approche in vitro, l’essai biologique sur cellules Caco-2 mérite une grande crédibilité en tant qu’outil de dépistage pour évaluer la nutrition Fe à partir des aliments. Il a été largement appliqué à de nombreux aliments et produits alimentaires 21,24,25,26,27,28.
Depuis sa création en 1998, l’essai biologique sur cellules Caco-2 a fait progresser le domaine de la nutrition Fe car il a aidé à identifier les facteurs qui influencent l’absorption intestinale du Fe. Ce faisant, ce modèle a développé et affiné des objectifs de recherche pour des études humaines plus définitives et moins coûteuses. On pourrait également soutenir que l’utilisation du modèle annule la nécessité de certains essais humains.
En résumé, l’apport relatif de Fe à partir d’un aliment ou d’un repas peut être mesuré avec le bioessai sur cellules Caco-2. Quelle que soit la quantité de Fe dans la farine d’essai, l’essai biologique définit la quantité relative de Fe absorbée dans l’entérocyte – la première étape du processus d’absorption. C’est l’étape la plus importante dans la définition de la biodisponibilité du Fe, car le plus souvent, l’objectif est de mesurer avec l’intention d’améliorer ou, à tout le moins, de surveiller la qualité nutritionnelle du Fe dans un aliment. Étant donné que le statut en fer est régulé par absorption, et donc l’absorption de Fe est régulée à la hausse chez les individus déficients en Fe pour répondre aux besoins nutritionnels, les conditions standard du modèle sont conçues de manière à ce que l’absorption de Fe par les cellules soit maximale. De cette façon, l’essai biologique fournit une véritable mesure du potentiel de l’aliment à fournir du Fe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Depuis sa création, de nombreuses études ont été publiées qui décrivent cette méthode pour le bioessai sur cellules Caco-2. Les conditions de base sont restées relativement inchangées depuis la publication initiale en 199818. Cependant, au cours des 20 dernières années, de nombreux détails techniques ont été affinés et normalisés pour obtenir une cohérence sans précédent dans la réponse du bioessai. Une adhésion minutieuse et précise à la culture cellulaire et aux conditions…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’auteur est profondément reconnaissant pour les efforts techniques de Yongpei Chang et Mary Bodis. L’application extrêmement réussie de ce modèle dans le domaine de la nutrition est le résultat direct de leur expertise et de leur souci du détail. Le développement de ce modèle a été entièrement financé par le Service de recherche agricole du Département de l’agriculture des États-Unis.
Materials
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
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