يمثل الفحص الحيوي لخلايا Caco-2 للتوافر البيولوجي للحديد (Fe) نهجا فعالا من حيث التكلفة ومتعدد الاستخدامات لتقييم التوافر البيولوجي للحديد من الأطعمة والمنتجات الغذائية والمكملات الغذائية والوجبات وحتى أنظمة النظام الغذائي. تم التحقق من صحته بدقة للدراسات البشرية ، وهو يمثل أحدث ما توصلت إليه دراسات التوافر البيولوجي Fe.
معرفة التوافر البيولوجي Fe أمر بالغ الأهمية لتقييم الجودة الغذائية للFe في الأطعمة. في الجسم الحي ، يكون قياس التوافر البيولوجي ل Fe محدودا بالتكلفة والإنتاجية والمحاذير المتأصلة في وضع العلامات النظيرية للأغذية Fe. وبالتالي، هناك حاجة ماسة إلى نهج يتسم بالإنتاجية العالية والفعالية من حيث التكلفة. تم تطوير المقايسة الحيوية لخلية Caco-2 لتلبية هذه الحاجة. يستخدم الفحص الحيوي لخلية Caco-2 للتوافر البيولوجي Fe محاكاة الهضم المعدي والمعوي إلى جانب زراعة خط الخلايا الظهارية المعوية البشرية المعروف باسم Caco-2. في خلايا Caco-2 ، يحفز امتصاص Fe التكوين داخل الخلايا للفيريتين ، وهو بروتين تخزين Fe يمكن قياسه بسهولة بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). أشكال الفيريتين بما يتناسب مع امتصاص Fe ؛ وبالتالي ، من خلال قياس إنتاج الفيريتين في خلايا Caco-2 ، يمكن للمرء تقييم امتصاص Fe المعوي من هضم الطعام المحاكي إلى الخلايا المعوية.
من خلال هذا النهج ، يكرر النموذج الخطوة الأولية الرئيسية التي تحدد التوافر البيولوجي للفيب الغذائي. منذ إنشائه في عام 1998 ، تمت مقارنة هذا النهج النموذجي بدقة بالعوامل المعروفة بتأثيرها على التوافر البيولوجي البشري للفي. علاوة على ذلك ، تم تطبيقه في دراسات موازية ، مع ثلاث دراسات للفعالية البشرية لتقييم المحاصيل المدعمة بيولوجيا Fe. في جميع الحالات ، تنبأت المقايسة الحيوية بشكل صحيح بالكميات النسبية من التوافر البيولوجي Fe من العوامل والمحاصيل والنظام الغذائي العام. تقدم هذه الورقة طرقا مفصلة حول زراعة خلايا Caco-2 إلى جانب عملية الهضم في المختبر وخلية الفيريتين ELISA اللازمة لإجراء المقايسة الحيوية لخلية Caco-2 للتوافر البيولوجي Fe.
لفهم الحاجة البحثية والاستفادة من المقايسة الحيوية لخلايا Caco-2 للتوافر البيولوجي Fe بشكل كامل ، يجب على المرء أولا فهم النهج التي كانت موجودة قبل ظهور هذا النموذج. يعد قياس التوافر البيولوجي للFe من طعام أو وجبة في الجسم الحي مهمة صعبة ، خاصة عندما تحتاج مجموعات من الطعام إلى تقييمها في وجبة أو نظام غذائي. كان وضع العلامات النظيرية هو النهج الأكثر شيوعا لقياس التوافر البيولوجي للFe على مدى السنوات ال 50 الماضية1. يستخدم وضع العلامات النظيرية للدراسات ذات الوجبة الواحدة والوجبات المتعددة وهو غير عملي للدراسات طويلة الأجل. النظائر المستقرة من Fe مثل 57Fe و 58Fe هي الأكثر استخداما. ومع ذلك ، فقد أجريت دراسات على النظائر المشعة مثل 59Fe ، باستخدام عد الجسم كله2. بالنسبة للأغذية النباتية ، تم وضع العلامات النظيرية عن طريق وضع العلامات الخارجية أو الداخلية. لوضع العلامات الخارجية ، تتم إضافة كمية معروفة من النظائر إلى الطعام أو الوجبة. ثم يتم خلط الطعام ، ويتم دمج فترة توازن 15-30 دقيقة في البروتوكول قبل الاستهلاك. الثقافة المائية – إضافة النظير إلى محلول المغذيات لدمجه في النبات أثناء نموه وتطوره – مطلوب لوضع العلامات الجوهرية على الأطعمة النباتية. وترد أدناه مناقشة لإيجابيات وسلبيات كل نهج.
وضع العلامات النظيرية الخارجية
في أوائل إلى منتصف 1970s ، تمت دراسة امتصاص Fe البشري عن طريق وضع العلامات الخارجية على Fe في الأطعمة ، حيث تتم إضافة كمية معروفة من النظائر إلى الكمية المعروفة من Fe في الطعام أو الوجبة ، مختلطة ، ومتوازنة لمدة 15-30 دقيقة قبل القياسات. تم استخدام كميات مختلفة من النظائر الخارجية ، تتراوح من 1٪ إلى 100٪ من Fe الجوهري ، ولكن الأكثر شيوعا في حدود 7٪ -30٪ 3. يعتمد وضع العلامات الخارجية على افتراض أن نظير Fe الخارجي يحصل على توازن كامل مع Fe الجوهري للطعام أو الوجبة. ثم يتم قياس امتصاص النظائر الخارجية، ويتم حساب كل ذرة من النظير الخارجي لتمثيل عدد معين من ذرات Fe الجوهرية. يعتمد هذا الحساب على الكميات المولية النسبية. في عام 1983 ، تم تلخيص دراسات التحقق المتعددة من صحة التقنية في ورقة مراجعة4. تم التحقق من صحة التقنية عن طريق مقارنة النسبة المئوية لامتصاص الملصق النظيري الخارجي في وقت واحد مع النسبة المئوية لامتصاص الملصق النظيري الداخلي. وبالتالي ، فإن نسبة الامتصاص الخارجي إلى الامتصاص الداخلي بالقرب من 1 تشير إلى أن كل تجمع من Fe تم امتصاصه بالتساوي. في ذلك الوقت ، اعتبرت نسبة قريبة من 1 أيضا أنها تمثل توازن النظير الخارجي مع Fe الجوهري للطعام أو الوجبة. وتراوحت نسب امتصاص الحديد الخارجي إلى الجوهري بين القيم المتوسطة من 0.40 إلى 1.62، مع متوسط نسبة (±SD) من 1.08 ± 0.14 في 63 مقارنة. من المهم ملاحظة أنه في جميع الدراسات الملخصة في هذه المراجعة ، لم يختبر أي منها بشكل مباشر توازن التسمية الخارجية مع Fe الجوهري. باختصار ، خلص مؤلفو المراجعة إلى ما يلي:
“أثبتت تقنية العلامة الخارجية أنها صالحة للعديد من الأطعمة في ظل ظروف تجريبية معينة. ولكن ، لا يمكن اعتبار هذه الطريقة مثبتة فيما يتعلق بجميع أنواع الأطعمة. طريقة العلامة الخارجية ليست مناسبة لمراقبة امتصاص الحديد من نظام غذائي يحتوي على أشكال غير قابلة للذوبان من الحديد. تعتمد صحة هذه التقنية على الافتراض الأساسي بأن العلامة الخارجية تتبادل تماما مع جميع حديد الطعام غير الهيم الداخلي. في الوقت الحاضر ، من غير المعروف كيف يتم تصنيف الأشكال المختلفة للحديد غير الهيم بالكامل بواسطة علامة خارجية. هذا مهم في ضوء الدراسات التي اقترحت أن مثبطات الحديد قد تؤثر على العلامة الخارجية بشكل مختلف عن بعض أشكال الحديد غير الهيم في الأطعمة. البحوث حول العوامل الغذائية التي يمكن أن تضعف التبادل الكامل للنظائر ضئيلة. وبالتالي ، فإن تفسير بيانات التوافر البيولوجي من أبحاث العلامات الخارجية يتطلب النظر في مثبطات التبادل التي قد تكون موجودة في الطعام أو النظام الغذائي. “
منذ عام 1983 ، تم نشر دراستين فقط قيمتا دقة وضع العلامات الخارجية ل Fe 3,5. وفي كلتا الدراستين، تمت مقارنة توازن الملصق النظيري الخارجي مباشرة مع الحديد الجوهري للأغذية، والتي كانت، في هاتين الدراستين، محاصيل غذائية أساسية. تم اختبار أصناف الفاصوليا البيضاء والحمراء والسوداء ، إلى جانب العدس والذرة. باستخدام تقنيات الهضم المختبرية الراسخة وقياس قابلية ذوبان الحديد وهطول الأمطار ، أظهرت كلتا الدراستين أن وضع العلامات النظيرية الخارجية لا يؤدي باستمرار إلى التوازن الكامل ، مع وجود أدلة على أنه بالنسبة لبعض أنواع الفاصوليا ، يمكن أن يكون سوء التوازن مرتفعا جدا اعتمادا على كمية النظائر الخارجية ولون معطف البذور3. على الرغم من استنتاجات ورقة المراجعة لعام 1983 ، استمرت دراسات وضع العلامات الخارجية للفاصوليا6،7،8،9،10،11،12. لم تتضمن أي من هذه الدراسات اختبار توازن الملصق الخارجي مع Fe الداخلي.
وضع العلامات الجوهرية
إن وضع العلامات الجوهرية للأغذية النباتية لتقييم التوافر البيولوجي للFe يلغي قضايا الدقة المتعلقة بالتوازن في وضع العلامات الخارجية. ومع ذلك ، لا يمكن لهذا النهج أن يسفر عن كميات كبيرة من المواد بسبب الحاجة إلى مساحة الدفيئة للزراعة المائية. الزراعة المائية كثيفة العمالة ، وتتطلب كمية عالية من النظائر المستقرة باهظة الثمن ، وغالبا ما تؤدي إلى نمو النبات بشكل مختلف من حيث الغلة وتركيز Fe البذور. نظرا للتكلفة ، فإن وضع العلامات الجوهرية مناسب فقط للدراسات الصغيرة التي تهدف إلى فهم الآليات الكامنة وراء امتصاص Fe أو العوامل التي تؤثر على امتصاص Fe من الأطعمة. يكلف إنتاج 1-2 كجم من محصول غذائي أساسي حوالي 20،000-30،000 دولار للمواد وحدها ، اعتمادا على النظائر والنهج المائي13،14.
وبالنظر إلى التحديات المرتبطة بوضع العلامات النظيرية، سعى الباحثون إلى وضع نهج في المختبر. استخدمت الطرق المبكرة محاكاة الغذاء المعدي والمعوي ، إلى جانب قياس قابلية ذوبان الحديد أو قابلية اللالة Fe كتقدير للتوافر البيولوجي15. وسرعان ما وجدت هذه الدراسات أن قابلية التحلل بالالحديد لم تكن مقياسا ثابتا للتوافر البيولوجي لأن الحديد يمكن أن يكون قابلا للذوبان ومرتبطا بإحكام بالمركبات، وبالتالي غير قابل للتبادل، مما يؤدي إلى المبالغة في تقدير التوافر البيولوجي. لمعالجة هذه القضايا ، تطورت منهجية استخدام خط الخلايا المعوية البشرية ، وبالتالي إضافة عنصر حي وتمكين قياس امتصاص Fe16. نشأت الخلايا المعوية البشرية – خلايا Caco-2 – من سرطان القولون البشري وتم استخدامها على نطاق واسع في دراسات امتصاص المغذيات. هذا الخط الخلوي مفيد لأنه في الثقافة ، تتمايز الخلايا إلى خلايا معوية تعمل بشكل مشابه لخلايا حدود الفرشاة في الأمعاء الدقيقة. وقد أظهرت الدراسات أن خلايا Caco-2 تظهر الناقلات المناسبة والاستجابة للعوامل التي تؤثر على امتصاص Fe17,18.
تم تنقيح الدراسات الأولية ، باستخدام النظائر المشعة لقياس امتصاص Fe في خلايا Caco-2 ، لقياس امتصاص Fe بناء على تكوين الفيريتين في خلية Caco-2. وأدى قياس الفيريتين الخلوي Caco-2 إلى تعزيز إنتاجية العينات ونفي قضايا مناولة النظائر المشعة وتوازن Fe الخارجي مع Fe19,20 الداخلي. مكن قياس امتصاص Fe عن طريق تكوين الفيريتين الباحثين من دراسة مجموعة واسعة من الأطعمة ، بما في ذلك الوجبات المعقدة21. وبالتالي ، فإن محاكاة الهضم (في المختبر) إلى جانب امتصاص Fe لخلية Caco-2 قدمت تقييما فسيولوجيا أفضل لامتصاص Fe من الأطعمة. من المهم ملاحظة أن هذا النموذج يحدد في المقام الأول الاختلافات النسبية في التوافر البيولوجي Fe. مثل العديد من خطوط الخلايا المفيدة ، أظهرت خلايا Caco-2 أيضا تباينا في الاستجابة ولكنها حافظت على اختلافات نسبية متسقة في امتصاص Fe بين الأطعمة. يمكن للتقنية المناسبة والاهتمام الدقيق بالتفاصيل تحسين استجابة تكوين الفيريتين الخلوية المتسقة في خلايا Caco-2.
يعرف نموذج الهضم في المختبر / خلية Caco-2 أيضا باسم الفحص الحيوي لخلية Caco-2. تم التحقق من صحة هذا الفحص بدقة من خلال المقارنة المباشرة مع الدراسات البشرية والحيوانية22. بالإضافة إلى المقارنة المتوازية المباشرة للفحص الحيوي مع تجارب الفعالية البشرية ، فقد ثبت أن هذا النموذج يظهر استجابة مماثلة نوعيا في امتصاص Fe لتلك الموجودة لدى البشر18،19،23. لذلك ، كنهج في المختبر ، فإن الفحص الحيوي لخلية Caco-2 يضمن مصداقية عالية كأداة فحص لتقييم تغذية Fe من الأطعمة. وقد تم تطبيقه على نطاق واسع على العديد من الأطعمة والمنتجات الغذائية21،24،25،26،27،28.
منذ إنشائها في عام 1998 ، طورت المقايسة الحيوية لخلايا Caco-2 مجال تغذية Fe لأنها ساعدت في تحديد العوامل التي تؤثر على امتصاص Fe المعوي. ومن خلال القيام بذلك، طور هذا النموذج وصقل أهدافا بحثية لإجراء دراسات بشرية أكثر تحديدا وأقل تكلفة. يمكن للمرء أيضا أن يجادل بأن استخدام النموذج ينفي الحاجة إلى بعض التجارب البشرية.
باختصار ، يمكن قياس التسليم النسبي ل Fe من طعام أو وجبة باستخدام الفحص الحيوي لخلية Caco-2. بغض النظر عن كمية Fe في وجبة الاختبار ، تحدد المقايسة الحيوية الكمية النسبية من Fe التي يتم تناولها في الخلايا المعوية – الخطوة الأولى من عملية الامتصاص. هذه هي الخطوة الأكثر أهمية في تعريف التوافر البيولوجي للFe ، حيث أن الهدف في معظم الأحيان هو القياس بقصد تحسين أو ، على الأقل ، مراقبة الجودة الغذائية ل Fe في الطعام. بالنظر إلى أن حالة الحديد يتم تنظيمها عن طريق الامتصاص ، وبالتالي يتم تنظيم امتصاص Fe في الأفراد الذين يعانون من نقص Fe لتلبية الاحتياجات الغذائية ، تم تصميم الشروط القياسية للنموذج بحيث يكون امتصاص Fe من قبل الخلايا هو الحد الأقصى. وبهذه الطريقة ، توفر المقايسة الحيوية مقياسا حقيقيا لإمكانات الطعام لتوصيل Fe.
منذ إنشائها ، تم نشر العديد من الدراسات التي تصف هذه الطريقة للفحص الحيوي لخلية Caco-2. وظلت الظروف الأساسية دون تغيير نسبيا منذ النشر الأولي في عام 199818. ومع ذلك ، على مدى السنوات ال 20 الماضية ، تم تنقيح العديد من التفاصيل التقنية وتوحيدها لتحقيق اتساق غير مسبوق في استجابة الفحص ا…
The authors have nothing to disclose.
ويعرب المؤلف عن امتنانه العميق للجهود التقنية التي بذلها يونغبي تشانغ وماري بوديس. التطبيق الناجح للغاية لهذا النموذج في مجال التغذية هو نتيجة مباشرة لخبرتهم واهتمامهم بالتفاصيل. تم تمويل تطوير هذا النموذج بالكامل من قبل وزارة الزراعة الأمريكية ، دائرة البحوث الزراعية.
0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
collagen | Corning | 354236 | |
dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
large column | VWR International | KT420400-1530 | |
Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |