Konstruktion af en human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip-model til rekapitulering af biomekanisk belastning i aortavæggen
Summary
Her udviklede vi en human aorta glat muskelcelleorgan-på-en-chip-model til at replikere den in vivo biomekaniske stamme af glatte muskelceller i den menneskelige aortavæg.
Abstract
Konventionelle todimensionelle cellekulturteknikker og dyremodeller er blevet anvendt i undersøgelsen af human thoraxaortaaneurisme og dissektion (TAAD). Imidlertid kan menneskelig TAAD undertiden ikke karakteriseres af dyremodeller. Der er en tilsyneladende artskløft mellem kliniske humane undersøgelser og dyreforsøg, der kan hindre opdagelsen af terapeutiske lægemidler. I modsætning hertil er den konventionelle cellekulturmodel ikke i stand til at simulere in vivo biomekaniske stimuli. Til dette formål har mikrofabrikation og mikrofluidiske teknikker udviklet sig meget i de senere år, hvilket giver nye teknikker til etablering af organoider-on-a-chip-modeller, der replikerer det biomekaniske mikromiljø. I denne undersøgelse blev der udviklet en human aorta glat muskelcelleorgan-på-en-chip (HASMC-OOC) model til at simulere de patofysiologiske parametre for aorta biomekanik, herunder amplituden og hyppigheden af cyklisk stamme oplevet af humane aorta glatte muskelceller (HASMC’er), der spiller en afgørende rolle i TAAD. I denne model blev HASMC’ernes morfologi langstrakt i form, justeret vinkelret på belastningsretningen og præsenterede en mere kontraktil fænotype under belastningsforhold end under statiske konventionelle forhold. Dette var i overensstemmelse med celleorienteringen og fænotypen i indfødte menneskelige aortavægge. Derudover etablerede vi BAV-TAAD- og TAV-TAAD-sygdomsmodeller ved hjælp af bicuspid aortaklap-relaterede TAAD (BAV-TAAD) og tricuspid aortaklaprelaterede TAAD (TAV-TAAD) patientafledte primære HASMC’er. HASMC-OOC-modellen giver en ny in vitro-platform , der supplerer dyremodeller til yderligere udforskning af patogenesen af TAAD og opdagelse af terapeutiske mål.
Introduction
Thorax aortaaneurisme og dissektion (TAAD) er en lokaliseret dilatation eller delaminering af aortavæggen, der er forbundet med høj sygelighed og dødelighed1. Humane aorta glatte muskelceller (HASMC’er) spiller en afgørende rolle i patogenesen af TAAD. HASMC’er er ikke terminalt differentierede celler, og HASMC’er bevarer høj plasticitet, så de kan skifte fænotyper som reaktion på forskellige stimuli2. HASMC’er udsættes hovedsageligt for rytmisk trækbelastning in vivo, og dette er en af nøglefaktorerne, der regulerer glatte muskelmorfologiske ændringer, differentiering og fysiologiske funktioner 3,4. Derfor kan cyklisk belastnings rolle i undersøgelsen af HASMC’er ikke ignoreres. Imidlertid kan konventionelle 2D-cellekulturer ikke replikere den biomekaniske stimulering af cyklisk stamme, som HASMC’er oplever in vivo. Derudover er konstruktionen af en TAAD-model til dyr ikke egnet til nogle typer TAAD, såsom bicuspid aortaklap (BAV) -relateret TAAD. Desuden kan artskløften mellem kliniske humane undersøgelser og dyreforsøg ikke ignoreres. Det hindrer farmaceutisk oversættelse i klinisk praksis. Der er således et presserende behov for mere komplekse og fysiologiske systemer til at simulere det in vivo biomekaniske miljø i forskningen af aortasygdomme.
Dyreforsøg, der anvendes i biomedicinsk forskning og lægemiddeludvikling, er dyre, tidskrævende og etisk tvivlsomme. Desuden kan resultaterne fra dyreforsøg ofte ikke forudsige de resultater, der er opnået i kliniske forsøg på mennesker 5,6. Manglen på humane prækliniske modeller og høj fejlrate i kliniske forsøg har resulteret i få effektive lægemidler til klinikken, hvilket har øget sundhedsomkostningerne7. Det haster derfor med at finde andre eksperimentelle modeller til at supplere dyremodeller. Mikrofabrikation og mikrofluidiske teknikker har udviklet sig meget i de senere år og giver nye teknikker til etablering af organoider-on-a-chip-modeller, der afhjælper ulemperne ved traditionelle 2D-cellekulturteknikker og etablerer en mere realistisk, billig og effektiv in vitro-model til fysiologiske undersøgelser og lægemiddeludvikling. Ved hjælp af mikrofluidiske enheder etableres organer-på-chips til dyrkning af levende celler i kamre på størrelse med mikrometer med forskellige stimuli for at replikere nøglefunktionerne i et væv eller organ. Systemet består af enkelte eller flere mikrofluidiske mikrokanaler, hvor enten en slags celle dyrkes i et perfunderet kammer, der replikerer funktioner af en vævstype eller forskellige celletyper dyrket på porøse membraner for at genskabe grænseflader mellem forskellige væv. Mikrofluidbaserede organoider kombineret med patientafledte celler har den unikke fordel at bygge bro over den store artsforskel mellem muse- og humane sygdomsmodeller og overvinde ulemperne ved traditionel 2D-cellekultur til sygdomsmekanismeforskning og lægemiddelopdagelse. Med den hurtige udvikling af mikrofluidik i de sidste par år har forskere indset nytten af in vitro organ-on-a-chip (OOC) modeller, der replikerer komplekse in vivo biologiske parametre8. Disse mikrofluidiske organoider simulerer in vitro biomekaniske miljøer, såsom cyklisk belastning, forskydningsspænding og væsketryk, hvilket giver et tredimensionelt (3D) cellekulturmiljø. Til dato er flere OOC-modeller blevet etableret for at simulere biomekaniske stimuli i organer som lunge9, nyre 10, lever11, tarm 12 og hjerte 13, men disse er ikke blevet anvendt bredt til undersøgelse af human aortasygdom.
I denne undersøgelse præsenterer vi en human aorta glat muskelcelleorgan-on-a-chip (HASMC-OOC) model, der kan kontrollere de biomimetiske mekaniske kræfter og rytmer, der anvendes på TAAD-patientafledte primære HASMC’er. Chippen består af trelags tykke plader af polydimethylsiloxan (PDMS) ætset med kanaler og to kommercialiserede meget fleksible PDMS-membraner. HASMC’er dyrkes på PDMS-membranerne. Kanalen i midten af chippen er fyldt med et kulturmedium til cellekultur. Chippens øverste og nederste kanaler er forbundet til et vakuumtrykforsyningssystem, der kan styre rytmen og frekvensen af mekanisk trækbelastning af PDMS-membranerne. Rytmisk stamme, der opleves af HASMC’er, kan simuleres i HASMC-OOC og replikere det biomekaniske mikromiljø af væv eller organ, der ikke er funktionelt opnåeligt med konventionelle 2D-kultursystemer. Med fordelen ved højopløsning, realtidsbilleddannelse og biomekanisk mikromiljø kan levende cellers biokemiske, genetiske og metaboliske aktiviteter studeres for vævsudvikling, organfysiologi, sygdomsætiologi, molekylære mekanismer og biomarkøridentifikation, hjerte-kar-sygdomme og aortasygdom. Kombineret med vævsspecifikke og patientceller kan dette system bruges til lægemiddelscreening, personlig medicin og toksicitetstest. Denne HASMC-OOC-model giver en ny in vitro-platform til undersøgelse af patogenesen af aortasygdommen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den hurtige udvikling af mikrofluidisk teknologi er OOC-modeller, der kan replikere den biologiske funktion og struktur af et eller flere organer in vitro, opstået i de senere år til applikationer inden for biologi, medicin og farmakologi15. OOC kan simulere nøglefunktioner i det menneskelige fysiologiske mikromiljø, der er afgørende for at udforske sygdomsmekanismer og fremme præklinisk lægemiddeloversættelse 8,16. Se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender, at dette arbejde blev støttet af tilskud fra Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (20ZR1411700), National Natural Science Foundation of China (81771971) og Shanghai Sailing Program (22YF1406600).
Materials
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow – application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
