Costruzione di un modello organ-on-a-chip di cellule muscolari lisce dell'aorta umana per ricapitolare la tensione biomeccanica nella parete aortica
Summary
Qui, abbiamo sviluppato un modello organ-on-a-chip di cellule muscolari lisce dell’aorta umana per replicare il ceppo biomeccanico in vivo delle cellule muscolari lisce nella parete aortica umana.
Abstract
Tecniche convenzionali di coltura cellulare bidimensionale e modelli animali sono stati utilizzati nello studio dell’aneurisma e della dissezione dell’aorta toracica umana (TAAD). Tuttavia, il TAAD umano a volte non può essere caratterizzato da modelli animali. C’è un apparente divario di specie tra gli studi clinici sull’uomo e gli esperimenti sugli animali che può ostacolare la scoperta di farmaci terapeutici. Al contrario, il modello di coltura cellulare convenzionale non è in grado di simulare stimoli biomeccanici in vivo . A tal fine, le tecniche di microfabbricazione e microfluidica si sono sviluppate notevolmente negli ultimi anni, fornendo nuove tecniche per stabilire modelli organoidi-on-a-chip che replicano il microambiente biomeccanico. In questo studio, è stato sviluppato un modello di organ-on-a-chip (HASMC-OOC) di cellule muscolari lisce dell’aorta umana per simulare i parametri fisiopatologici della biomeccanica aortica, compresa l’ampiezza e la frequenza della tensione ciclica sperimentata dalle cellule muscolari lisce aortiche umane (HASMC) che svolgono un ruolo vitale nella TAAD. In questo modello, la morfologia degli HASMC è diventata di forma allungata, allineata perpendicolarmente alla direzione della deformazione e ha presentato un fenotipo più contrattile in condizioni di deformazione rispetto alle condizioni convenzionali statiche. Ciò era coerente con l’orientamento e il fenotipo cellulare nelle pareti aortiche umane native. Inoltre, utilizzando TAAD (BAV-TAAD) correlati alla valvola aortica bicuspide e HASMC primari derivati dal paziente TAAD (TAV-TAAD) correlati alla valvola aortica tricuspide, abbiamo stabilito modelli di malattia BAV-TAAD e TAV-TAAD, che replicano le caratteristiche HASMC in TAAD. Il modello HASMC-OOC fornisce una nuova piattaforma in vitro complementare ai modelli animali per esplorare ulteriormente la patogenesi della TAAD e scoprire bersagli terapeutici.
Introduction
L’aneurisma e la dissezione dell’aorta toracica (TAAD) sono una dilatazione localizzata o delaminazione della parete aortica associata ad elevata morbilità e mortalità1. Le cellule muscolari lisce aortiche umane (HASMC) svolgono un ruolo vitale nella patogenesi della TAAD. Gli HASMC non sono cellule differenziate terminalmente e gli HASMC mantengono un’elevata plasticità, consentendo loro di cambiare fenotipo in risposta a stimoli diversi2. Gli HASMC sono principalmente sottoposti a tensione ritmica di trazione in vivo, e questo è uno dei fattori chiave che regolano i cambiamenti morfologici della muscolatura liscia, la differenziazione e le funzioni fisiologiche 3,4. Pertanto, il ruolo della deformazione ciclica nello studio degli HASMC non può essere ignorato. Tuttavia, le colture cellulari 2D convenzionali non possono replicare la stimolazione biomeccanica del ceppo ciclico sperimentato dagli HASMC in vivo. Inoltre, la costruzione di un modello TAAD animale non è adatta per alcuni tipi di TAAD, come il TAAD correlato alla valvola aortica bicuspide (BAV). Inoltre, il divario di specie tra studi clinici sull’uomo e esperimenti sugli animali non può essere ignorato. Ostacola la traduzione farmaceutica nella pratica clinica. Pertanto, vi è un urgente bisogno di sistemi più complessi e fisiologici per simulare l’ambiente biomeccanico in vivo nella ricerca delle malattie aortiche.
Gli esperimenti sugli animali utilizzati nella ricerca biomedica e nello sviluppo di farmaci sono costosi, dispendiosi in termini di tempo ed eticamente discutibili. Inoltre, i risultati degli studi sugli animali spesso non riescono a prevedere i risultati ottenuti nelle sperimentazioni cliniche sull’uomo 5,6. La mancanza di modelli preclinici umani e l’alto tasso di fallimento negli studi clinici hanno portato a pochi farmaci efficaci per la clinica, il che ha aumentato i costi dell’assistenza sanitaria7. Pertanto, è urgente trovare altri modelli sperimentali per integrare i modelli animali. Le tecniche di microfabbricazione e microfluidica si sono sviluppate notevolmente negli ultimi anni, fornendo nuove tecniche per stabilire modelli organoidi-on-a-chip che rimediano agli inconvenienti delle tradizionali tecniche di coltura cellulare 2D e stabiliscono un modello in vitro più realistico, a basso costo ed efficiente per studi fisiologici e sviluppo di farmaci. Utilizzando dispositivi microfluidici, gli organi su chip vengono stabiliti per coltivare cellule viventi in camere di dimensioni micrometriche con stimoli diversi per replicare le funzioni chiave di un tessuto o organo. Il sistema è costituito da microcanali microfluidici singoli o multipli, con un tipo di cellula coltivata in una camera perfusa che replica le funzioni di un tipo di tessuto o diversi tipi di cellule coltivate su membrane porose per ricreare interfacce tra diversi tessuti. Gli organoidi a base microfluidica combinati con cellule derivate dal paziente hanno il vantaggio unico di colmare la grande differenza di specie tra modelli di malattie muniche e umane e superare gli svantaggi della tradizionale coltura cellulare 2D per la ricerca sui meccanismi della malattia e la scoperta di farmaci. Con il rapido sviluppo della microfluidica negli ultimi anni, i ricercatori hanno compreso l’utilità di modelli in vitro organ-on-a-chip (OOC) che replicano complessi parametri biologici in vivo 8. Questi organoidi microfluidici simulano ambienti biomeccanici in vitro, come la deformazione ciclica, lo sforzo di taglio e la pressione del liquido, fornendo un ambiente di coltura cellulare tridimensionale (3D). Ad oggi, sono stati stabiliti diversi modelli OOC per simulare stimoli biomeccanici in organi come il polmone9, il rene 10, il fegato11, l’intestino 12 e il cuore 13, ma questi non sono stati ampiamente applicati allo studio della malattia dell’aorta umana.
In questo studio, presentiamo un modello di organo su chip (HASMC-OOC) di cellule muscolari lisce dell’aorta umana in grado di controllare le forze e i ritmi meccanici biomimetici applicati agli HASMC primari derivati dal paziente TAAD. Il chip è costituito da piastre spesse a tre strati di polidimetilsilossano (PDMS) incise con canali e due membrane PDMS altamente flessibili commercializzate. Gli HASMC sono coltivati sulle membrane PDMS. Il canale al centro del chip è riempito con un terreno di coltura per la coltura cellulare. I canali superiore e inferiore del chip sono collegati a un sistema di alimentazione a pressione del vuoto in grado di controllare il ritmo e la frequenza della deformazione meccanica di trazione delle membrane PDMS. La deformazione ritmica sperimentata dagli HASMC può essere simulata in HASMC-OOC, replicando il microambiente biomeccanico di tessuti o organi non funzionalmente realizzabili con i sistemi di coltura 2D convenzionali. Con il vantaggio dell’imaging ad alta risoluzione e in tempo reale e del microambiente biomeccanico, le attività biochimiche, genetiche e metaboliche delle cellule viventi possono essere studiate per lo sviluppo dei tessuti, la fisiologia degli organi, l’eziologia della malattia, i meccanismi molecolari e l’identificazione dei biomarcatori, le malattie cardiovascolari e le malattie aortiche. In combinazione con cellule tessuto-specifiche e pazienti, questo sistema può essere utilizzato per lo screening farmacologico, la medicina personalizzata e i test di tossicità. Questo modello HASMC-OOC fornisce una nuova piattaforma in vitro per lo studio della patogenesi della malattia aortica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con il rapido sviluppo della tecnologia microfluidica, negli ultimi anni sono emersi modelli OOC in grado di replicare la funzione biologica e la struttura di uno o più organi in vitro per applicazioni in biologia, medicina e farmacologia15. L’OOC può simulare funzioni chiave del microambiente fisiologico umano, essenziali per esplorare i meccanismi della malattia e promuovere la traduzione preclinica dei farmaci 8,16. Sebbene l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono che questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Commissione per la scienza e la tecnologia della municipalità di Shanghai (20ZR1411700), della National Natural Science Foundation of China (81771971) e del Shanghai Sailing Program (22YF1406600).
Materials
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
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