Построение модели гладкомышечных клеток гладкой мускулатуры человека для рекапитуляции биомеханического штамма в стенке аорты
Summary
Здесь мы разработали модель гладкомышечных клеток гладкой мускулатуры человека для репликации биомеханического штамма гладкомышечных клеток в стенке аорты человека in vivo .
Abstract
Обычные двухмерные методы культивирования клеток и животные модели были использованы при изучении аневризмы и расслоения грудной аорты человека (TAAD). Однако человеческий TAAD иногда не может быть охарактеризован животными моделями. Существует очевидный видовой разрыв между клиническими исследованиями на людях и экспериментами на животных, которые могут препятствовать открытию терапевтических препаратов. Напротив, обычная модель клеточной культуры не может имитировать биомеханические стимулы in vivo . С этой целью в последние годы значительно развились микрофабрикационные и микрофлюидные методы, обеспечивающие новые методы создания моделей органоидов на чипе, которые воспроизводят биомеханическую микросреду. В этом исследовании была разработана модель гладкомышечных клеток аорты человека (HASMC-OOC) для моделирования патофизиологических параметров биомеханики аорты, включая амплитуду и частоту циклического напряжения, испытываемого гладкомышечными клетками аорты человека (HASMC), которые играют жизненно важную роль в TAAD. В этой модели морфология HASMC стала вытянутой по форме, выровненной перпендикулярно направлению деформации и представляла собой более сократительный фенотип в условиях деформации, чем в статических обычных условиях. Это соответствовало ориентации клеток и фенотипу в стенках аорты человека. Кроме того, используя двустворчатые TAAD, связанные с аортальным клапаном (BAV-TAAD) и TRICUSPID Aortic Valve, связанные с TAAD (TAV-TAAD), полученные от пациентов, мы создали модели заболеваний BAV-TAAD и TAV-TAAD, которые воспроизводят характеристики HASMC в TAAD. Модель HASMC-OOC предоставляет новую платформу in vitro , которая дополняет животные модели для дальнейшего изучения патогенеза TAAD и обнаружения терапевтических мишеней.
Introduction
Аневризма и расслоение грудной аорты (TAAD) представляет собой локализованную дилатацию или расслоение стенки аорты, что связано с высокой заболеваемостью и смертностью1. Гладкомышечные клетки аорты человека (HASMC) играют жизненно важную роль в патогенезе TAAD. HASMC не являются терминально дифференцированными клетками, и HASMC сохраняют высокую пластичность, что позволяет им переключать фенотипы в ответ на различные стимулы2. ХАСМК в основном подвергаются ритмическому растягиванию in vivo, и это один из ключевых факторов, регулирующих морфологические изменения гладкой мускулатуры, дифференцировку и физиологические функции 3,4. Поэтому роль циклического штамма в изучении HASMC нельзя игнорировать. Однако обычные 2D-клеточные культуры не могут воспроизводить биомеханическую стимуляцию циклического штамма, испытываемую HASMC in vivo. Кроме того, конструкция модели TAAD животного не подходит для некоторых типов TAAD, таких как TAAD, связанный с двустворчатым аортальным клапаном (BAV). Более того, нельзя игнорировать видовой разрыв между клиническими исследованиями на людях и экспериментами на животных. Это препятствует фармацевтическому переводу в клинической практике. Таким образом, существует острая необходимость в более сложных и физиологических системах для моделирования биомеханической среды in vivo при исследовании заболеваний аорты.
Эксперименты на животных, используемые в биомедицинских исследованиях и разработке лекарств, являются дорогостоящими, трудоемкими и этически сомнительными. Кроме того, результаты исследований на животных часто не могут предсказать результаты, полученные в клинических испытаниях на людях 5,6. Отсутствие доклинических моделей на людях и высокая частота неудач в клинических испытаниях привели к тому, что в клинике было мало эффективных лекарств, что увеличило расходы на здравоохранение7. Таким образом, необходимо срочно найти другие экспериментальные модели, дополняющие животные модели. Микрофабрикация и микрофлюидные методы значительно развились в последние годы, предоставляя новые методы для создания моделей органоидов на чипе, которые устраняют недостатки традиционных методов 2D-культивирования клеток и создают более реалистичную, недорогую и эффективную модель in vitro для физиологических исследований и разработки лекарств. Используя микрофлюидные устройства, органы на чипах устанавливаются для культивирования живых клеток в камерах размером с микрометр с различными стимулами для воспроизведения ключевых функций ткани или органа. Система состоит из одного или нескольких микрофлюидных микроканалов, причем либо один вид клеток культивируется в перфузированной камере, реплицирующих функции одного типа ткани, либо различные типы клеток, культивируемые на пористых мембранах для воссоздания интерфейсов между различными тканями. Органоиды на основе микрофлюидов в сочетании с клетками, полученными от пациента, имеют уникальное преимущество, заключающееся в преодолении большой видовой разницы между моделями заболеваний мыши и человека и преодолении недостатков традиционной 2D-клеточной культуры для исследования механизма заболевания и открытия лекарств. С быстрым развитием микрофлюидики в последние несколько лет исследователи осознали полезность моделей in vitro organ-on-a-chip (OOC), воспроизводящих сложные биологические параметры in vivo 8. Эти микрофлюидные органоиды имитируют биомеханические среды in vitro, такие как циклическая деформация, напряжение сдвига и давление жидкости, обеспечивая трехмерную (3D) среду клеточной культуры. На сегодняшний день было создано несколько моделей OOC для моделирования биомеханических стимулов в таких органах, как легкие9, почки10, печень11, кишечник12 и сердце13, но они не были широко применены для изучения заболеваний аорты человека.
В этом исследовании мы представляем модель гладкомышечных клеток гладкой мускулатуры человека (HASMC-OOC), которая может контролировать биомиметические механические силы и ритмы, применяемые к первичным HASMC, полученным от пациента TAAD. Чип состоит из трехслойных толстых пластин полидиметилсилоксана (PDMS), вытравленных каналами, и двух коммерциализированных высокогибких мембран PDMS. HASMC культивируются на мембранах PDMS. Канал в середине чипа заполнен питательной средой для клеточной культуры. Верхний и нижний каналы чипа соединены с вакуумной системой подачи давления, которая может контролировать ритм и частоту механической растягивающей деформации мембран PDMS. Ритмическое напряжение, испытываемое HASMC, может быть смоделировано в HASMC-OOC, воспроизводя биомеханическое микроокружение ткани или органа, функционально не достижимое с помощью обычных систем 2D-культур. Благодаря преимуществу визуализации в режиме реального времени и биомеханической микросреды биохимическая, генетическая и метаболическая активность живых клеток может быть изучена для развития тканей, физиологии органов, этиологии заболеваний, молекулярных механизмов и идентификации биомаркеров, сердечно-сосудистых заболеваний и заболеваний аорты. В сочетании с тканеспецифическими клетками и клетками пациента эта система может использоваться для скрининга лекарств, персонализированной медицины и тестирования токсичности. Эта модель HASMC-OOC предоставляет новую платформу in vitro для изучения патогенеза заболевания аорты.
Protocol
Representative Results
Discussion
С быстрым развитием микрофлюидной технологии в последние годы появились модели OOC, которые могут воспроизводить биологическую функцию и структуру одного или нескольких органов in vitro для применения в биологии, медицине и фармакологии15. OOC может моделировать ключевые ф…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, что эта работа была поддержана грантами Комиссии по науке и технике муниципалитета Шанхая (20ZR1411700), Национального фонда естественных наук Китая (81771971) и Шанхайской парусной программы (22YF1406600).
Materials
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow – application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
