Aort Duvarındaki Biyomekanik Suşu Özetlemek İçin İnsan Aort Düz Kas Hücresi Organ-On-A-Chip Modelinin Yapımı
Summary
Burada, insan aort duvarındaki düz kas hücrelerinin in vivo biyomekanik suşunu çoğaltmak için bir insan aort düz kas hücresi organı-on-a-chip modeli geliştirdik.
Abstract
İnsan torasik aort anevrizması ve diseksiyonu (TAAD) çalışmasında geleneksel iki boyutlu hücre kültürü teknikleri ve hayvan modelleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, insan TAAD bazen hayvan modelleri ile karakterize edilemez. Klinik insan çalışmaları ile hayvan deneyleri arasında, terapötik ilaçların keşfini engelleyebilecek belirgin bir tür boşluğu vardır. Buna karşılık, geleneksel hücre kültürü modeli in vivo biyomekanik uyaranları simüle edemez. Bu amaçla, mikrofabrikasyon ve mikroakışkan teknikler son yıllarda büyük ölçüde gelişmiş ve biyomekanik mikro çevreyi kopyalayan çip üzerinde organoidler modelleri oluşturmak için yeni teknikler sağlamıştır. Bu çalışmada, TAAD’da hayati bir rol oynayan insan aort düz kas hücrelerinin (HASMC’ler) yaşadığı siklik suşun genliği ve sıklığı da dahil olmak üzere aort biyomekaniğinin patofizyolojik parametrelerini simüle etmek için bir insan aort düz kas hücresi organı-on-a-chip (HASMC-OOC) modeli geliştirilmiştir. Bu modelde, HASMC’lerin morfolojisi şekil olarak uzamış, gerinim yönüne dik olarak hizalanmış ve gerinim koşulları altında statik konvansiyonel koşullara göre daha kasılı bir fenotip sunmuştur. Bu, doğal insan aort duvarlarındaki hücre oryantasyonu ve fenotipi ile tutarlıydı. Ek olarak, biküspid aort kapağı ile ilişkili TAAD (BAV-TAAD) ve triküspid aort kapağı ile ilişkili TAAD (TAV-TAAD) hasta kaynaklı primer HASMC’leri kullanarak, TAAD’da HASMC özelliklerini kopyalayan BAV-TAAD ve TAV-TAAD hastalık modellerini kurduk. HASMC-OOC modeli, TAAD’ın patogenezini daha fazla araştırmak ve terapötik hedefleri keşfetmek için hayvan modellerini tamamlayan yeni bir in vitro platform sunmaktadır.
Introduction
Torasik aort anevrizması ve diseksiyonu (TAAD), yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkili olan aort duvarının lokalize dilatasyonu veya delaminasyonudur1. İnsan aort düz kas hücreleri (HASMC’ler) TAAD’ın patogenezinde hayati bir rol oynamaktadır. HASMC’ler ölümcül olarak farklılaşmış hücreler değildir ve HASMC’ler yüksek plastisiteyi koruyarak farklı uyaranlara yanıt olarak fenotipleri değiştirmelerine izin verir2. HASMC’ler esas olarak in vivo ritmik gerilme suşuna maruz kalırlar ve bu düz kas morfolojik değişikliklerini, farklılaşmasını ve fizyolojik fonksiyonlarını düzenleyen anahtar faktörlerden biridir 3,4. Bu nedenle, HASMC’lerin çalışmasında siklik suşun rolü göz ardı edilemez. Bununla birlikte, geleneksel 2D hücre kültürleri, HASMC’lerin in vivo olarak yaşadığı siklik suşun biyomekanik stimülasyonunu çoğaltamaz. Ek olarak, bir hayvan TAAD modelinin yapımı, biküspid aort kapağı (BAV) ile ilişkili TAAD gibi bazı TAAD türleri için uygun değildir. Dahası, klinik insan çalışmaları ile hayvan deneyleri arasındaki tür farkı göz ardı edilemez. Klinik pratikte farmasötik translasyonu engellemektedir. Bu nedenle, aort hastalıklarının araştırılmasında in vivo biyomekanik ortamı simüle etmek için daha karmaşık ve fizyolojik sistemlere acil bir ihtiyaç vardır.
Biyomedikal araştırma ve ilaç geliştirmede kullanılan hayvan deneyleri maliyetli, zaman alıcı ve etik olarak sorgulanabilir. Ek olarak, hayvan çalışmalarından elde edilen sonuçlar sıklıkla insan klinik çalışmalarında elde edilen sonuçları tahmin edememektedir 5,6. İnsan preklinik modellerinin eksikliği ve klinik çalışmalardaki yüksek başarısızlık oranı, klinik için az sayıda etkili ilaçla sonuçlanmış ve bu da sağlık bakım maliyetlerini artırmıştır7. Bu nedenle, hayvan modellerini tamamlamak için başka deneysel modeller bulmak acildir. Mikrofabrikasyon ve mikroakışkan teknikler son yıllarda büyük ölçüde gelişmiştir ve geleneksel 2D hücre kültürü tekniklerinin dezavantajlarını gideren ve fizyolojik çalışmalar ve ilaç geliştirme için daha gerçekçi, düşük maliyetli ve verimli bir in vitro model oluşturan çip üzerinde organoidler modelleri oluşturmak için yeni teknikler sağlamıştır. Mikroakışkan cihazlar kullanılarak, bir doku veya organın temel işlevlerini çoğaltmak için farklı uyaranlara sahip mikrometre büyüklüğündeki odalarda canlı hücreleri kültürlemek için çip üzerindeki organlar kurulur. Sistem, tek veya çoklu mikroakışkan mikrokanallardan oluşur; ya bir doku tipinin işlevlerini çoğaltan perfüze edilmiş bir odada kültürlenmiş bir tür hücre ya da farklı dokular arasındaki arayüzleri yeniden oluşturmak için gözenekli membranlar üzerinde kültürlenmiş farklı hücre tipleri. Hasta kaynaklı hücrelerle birleştirilen mikroakışkan bazlı organoidler, fare ve insan hastalığı modelleri arasındaki büyük tür farkını köprüleme ve hastalık mekanizması araştırması ve ilaç keşfi için geleneksel 2D hücre kültürünün dezavantajlarının üstesinden gelme konusunda benzersiz bir avantaja sahiptir. Son birkaç yılda mikroakışkanların hızlı bir şekilde gelişmesiyle birlikte, araştırmacılar kompleks in vivo biyolojik parametreleri kopyalayan in vitro çip üzerinde organ (OOC) modellerinin yararlılığını fark etmişlerdir8. Bu mikroakışkan organoidler, siklik gerinim, kesme gerilmesi ve sıvı basıncı gibi in vitro biyomekanik ortamları simüle ederek üç boyutlu (3B) bir hücre kültürü ortamı sağlar. Bugüne kadar, akciğer9, böbrek 10, karaciğer 11, bağırsak12 ve kalp13 gibi organlarda biyomekanik uyaranları simüle etmek için çeşitli OOC modelleri kurulmuştur, ancak bunlar insan aort hastalığının incelenmesine yaygın olarak uygulanmamıştır.
Bu çalışmada, TAAD hasta kaynaklı primer HASMC’lere uygulanan biyomimetik mekanik kuvvetleri ve ritimleri kontrol edebilen bir insan aort düz kas hücre organı-on-a-chip (HASMC-OOC) modeli sunulmuştur. Çip, kanallarla kazınmış üç katmanlı kalın polidimetilsiloksan (PDMS) plakalarından ve ticarileştirilmiş iki yüksek esnekliğe sahip PDMS membranından oluşur. HASMC’ler PDMS membranları üzerinde kültürlenir. Çipin ortasındaki kanal, hücre kültürü için bir kültür ortamı ile doldurulur. Çipin üst ve alt kanalları, PDMS membranlarının mekanik çekme geriniminin ritmini ve frekansını kontrol edebilen bir vakum basıncı besleme sistemine bağlanır. HASMC’lerin yaşadığı ritmik gerinim, HASMC-OOC’de simüle edilebilir ve geleneksel 2D kültür sistemleriyle işlevsel olarak elde edilemeyen doku veya organın biyomekanik mikro ortamını çoğaltır. Yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görüntüleme ve biyomekanik mikroçevre avantajı ile canlı hücrelerin biyokimyasal, genetik ve metabolik aktiviteleri doku gelişimi, organ fizyolojisi, hastalık etiyolojisi, moleküler mekanizmalar ve biyobelirteç tanımlama, kardiyovasküler hastalık ve aort hastalığı açısından incelenebilir. Dokuya özgü ve hasta hücreleri ile birleştirilen bu sistem, ilaç taraması, kişiselleştirilmiş tıp ve toksisite testi için kullanılabilir. Bu HASMC-OOC modeli, aort hastalığının patogenezini incelemek için yeni bir in vitro platform sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroakışkan teknolojisinin hızla gelişmesiyle birlikte, biyoloji, tıp ve farmakoloji uygulamaları için son yıllarda bir veya daha fazla organın biyolojik fonksiyonunu ve yapısını in vitro olarak kopyalayabilen OOC modelleri ortaya çıkmıştır15. OOC, hastalık mekanizmalarını araştırmak ve klinik öncesi ilaç translasyonunu teşvik etmek için gerekli olan insan fizyolojik mikro çevresinin temel işlevlerini simüle edebilir 8,16<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu çalışmanın Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (20ZR1411700), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81771971) ve Şanghay Yelken Programı (22YF1406600) tarafından desteklendiğini kabul etmektedir.
Materials
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow – application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
