Summary
כאן פיתחנו מודל של איבר על-שבב של תאי שריר חלקים באבי העורקים כדי לשכפל את הזן הביומכני in vivo של תאי שריר חלקים בדופן אבי העורקים האנושי.
Abstract
טכניקות קונבנציונליות של תרביות תאים דו-ממדיות ומודלים של בעלי חיים שימשו במחקר של מפרצת ודיסקציה של אבי העורקים החזי האנושי (TAAD). עם זאת, TAAD אנושי לפעמים לא יכול להיות מאופיין על ידי מודלים של בעלי חיים. קיים פער מינים לכאורה בין מחקרים קליניים בבני אדם לבין ניסויים בבעלי חיים שעשויים לעכב גילוי של תרופות טיפוליות. לעומת זאת, מודל תרבית התאים הקונבנציונלי אינו מסוגל לדמות גירויים ביומכניים in vivo . לשם כך, טכניקות מיקרו-פבריקציה ומיקרופלואידיות התפתחו מאוד בשנים האחרונות, ומספקות טכניקות חדשניות לביסוס מודלים של אורגנואידים על שבב המשכפלים את המיקרו-סביבה הביומכנית. במחקר זה פותח מודל של איבר-על-שבב של תאי שריר חלקים של אבי העורקים (HASMC-OOC) כדי לדמות את הפרמטרים הפתופיזיולוגיים של ביומכניקה של אבי העורקים, כולל המשרעת והתדירות של מאמץ מחזורי שחווים תאי שריר חלק באבי העורקים האנושי (HASMCs) הממלאים תפקיד חיוני ב-TAAD. במודל זה, המורפולוגיה של HASMCs התארכה בצורתה, התיישרה בניצב לכיוון המתח, והציגה פנוטיפ מתכווץ יותר בתנאי מאמץ מאשר בתנאים קונבנציונליים סטטיים. זה עלה בקנה אחד עם כיוון התא והפנוטיפ בדפנות אבי העורקים האנושי המקומי. בנוסף, תוך שימוש ב-TAAD (BAV-TAAD) הקשור למסתם אבי העורקים ו-TAAD (TAV-TAAD) הקשור למסתם אבי העורקים טריקוספיד שמקורו בחולי HASMCs, הקמנו מודלים של מחלות BAV-TAAD ו-TAV-TAAD, המשכפלים את מאפייני HASMC ב-TAAD. מודל HASMC-OOC מספק פלטפורמה חדשנית במבחנה המשלימה מודלים של בעלי חיים להמשך חקר הפתוגנזה של TAAD וגילוי מטרות טיפוליות.
Introduction
מפרצת ודיסקציה של אבי העורקים החזי (TAAD) היא הרחבה מקומית או דלמינציה של דופן אבי העורקים הקשורה לתחלואה גבוהה ותמותה1. תאי שריר חלק באבי העורקים האנושי (HASMCs) ממלאים תפקיד חיוני בפתוגנזה של TAAD. HASMCs אינם תאים ממוינים באופן סופני, ו- HASMCs שומרים על פלסטיות גבוהה, מה שמאפשר להם להחליף פנוטיפים בתגובה לגירויים שונים2. HASMCs נתונים בעיקר למתח מתיחה קצבי in vivo, וזהו אחד הגורמים המרכזיים המווסתים שינויים מורפולוגיים בשרירים חלקים, התמיינות ותפקודים פיזיולוגיים 3,4. לכן, לא ניתן להתעלם מתפקידו של זן מחזורי בחקר ה- HASMCs. עם זאת, תרביות תאים דו-ממדיות קונבנציונליות אינן יכולות לשכפל את הגירוי הביומכני של זן מחזורי שחווים HASMCs in vivo. בנוסף, בניית מודל TAAD של בעלי חיים אינה מתאימה לסוגים מסוימים של TAAD, כגון TAAD הקשור לשסתום אבי העורקים הביקוספיד (BAV). יתר על כן, לא ניתן להתעלם מהפער בין מחקרים קליניים בבני אדם לניסויים בבעלי חיים. זה מעכב את התרגום הפרמצבטי בפרקטיקה הקלינית. לפיכך, יש צורך דחוף במערכות מורכבות ופיזיולוגיות יותר כדי לדמות את הסביבה הביומכנית in vivo במחקר של מחלות אבי העורקים.
ניסויים בבעלי חיים המשמשים במחקר ביו-רפואי ובפיתוח תרופות הם יקרים, גוזלים זמן ומוטלים בספק מבחינה אתית. בנוסף, התוצאות ממחקרים בבעלי חיים לעתים קרובות אינן מצליחות לחזות את התוצאות המתקבלות בניסויים קליניים בבני אדם 5,6. היעדר מודלים פרה-קליניים אנושיים ושיעור הכישלון הגבוה בניסויים קליניים הביאו למעט תרופות יעילות למרפאה, מה שהגדיל את עלויות הטיפול הרפואי7. לכן, דחוף למצוא מודלים ניסיוניים אחרים כדי להשלים מודלים של בעלי חיים. טכניקות מיקרו-פבריקציה ומיקרופלואידיות התפתחו מאוד בשנים האחרונות, ומספקות טכניקות חדשניות לביסוס מודלים של אורגנואידים על שבב המתקן את החסרונות של טכניקות מסורתיות של תרביות תאים דו-ממדיות ומבססים מודל in-vitro מציאותי יותר, בעלות נמוכה ויעילה יותר למחקרים פיזיולוגיים ופיתוח תרופות. באמצעות התקנים מיקרופלואידיים, איברים על שבבים נוצרים כדי לתרבת תאים חיים בתאים בגודל מיקרומטר עם גירויים שונים כדי לשכפל את הפונקציות העיקריות של רקמה או איבר. המערכת מורכבת ממיקרו-תעלות מיקרופלואידיות בודדות או מרובות, כאשר סוג אחד של תאים מתרבית בתא משוכפל פונקציות מסוג רקמה אחד או סוגי תאים שונים בתרבית על ממברנות נקבוביות כדי ליצור מחדש ממשקים בין רקמות שונות. לאורגנואידים מבוססי מיקרופלואידיקה בשילוב עם תאים שמקורם בחולה יש יתרון ייחודי של גישור על ההבדלים בין המינים הגדולים בין מודלים של מחלות עכברים ובני אדם והתגברות על החסרונות של תרבית תאים דו-ממדית מסורתית לצורך מחקר מנגנוני מחלה וגילוי תרופות. עם ההתפתחות המהירה של מיקרופלואידיקה בשנים האחרונות, חוקרים הבינו את התועלת של מודלים של איבר על שבב (OOC) במבחנה המשכפלים פרמטרים ביולוגיים מורכבים in vivo 8. אורגנואידים מיקרופלואידיים אלה מדמים סביבות ביומכניות במבחנה, כגון מתח מחזורי, עקת גזירה ולחץ נוזלי, ומספקים סביבת תרבית תאים תלת-ממדית (3D). עד כה, מספר מודלים OOC הוקמו כדי לדמות גירויים ביומכניים באיברים כגון הריאה9, כליה 10, כבד11, המעי 12, ולב 13, אבל אלה לא יושמו באופן נרחב על המחקר של מחלת אבי העורקים האנושי.
במחקר זה, אנו מציגים מודל של איבר-על-שבב של תאי שריר חלקים של אבי העורקים האנושי (HASMC-OOC) שיכול לשלוט בכוחות ובמקצבים המכניים הביומימטיים המופעלים על HASMCs ראשוניים שמקורם ב-TAAD. השבב מורכב מלוחות עבים תלת-שכבתיים של פולידימתילסילוקסן (PDMS) החרוטים בתעלות ושני ממברנות PDMS ממוסחרות וגמישות במיוחד. HASMCs מתורבתים על ממברנות PDMS. הערוץ במרכז השבב מלא במדיום תרבית לתרבית תאים. הערוצים העליונים והתחתונים של השבב מחוברים למערכת אספקת לחץ ואקום שיכולה לשלוט בקצב ובתדירות של מתח מתיחה מכני של ממברנות PDMS. ניתן לדמות זן קצבי שחווים HASMCs ב-HASMC-OOC, תוך שכפול המיקרו-סביבה הביומכנית של רקמה או איבר שאינם ניתנים להשגה פונקציונלית עם מערכות תרבית דו-ממדיות קונבנציונליות. עם היתרון של הדמיה בזמן אמת ברזולוציה גבוהה ומיקרו-סביבה ביומכנית, ניתן לחקור את הפעילויות הביוכימיות, הגנטיות והמטבוליות של תאים חיים להתפתחות רקמות, פיזיולוגיה של איברים, אטיולוגיה של מחלות, מנגנונים מולקולריים וזיהוי סמנים ביולוגיים, מחלות לב וכלי דם ומחלות אבי העורקים. בשילוב עם תאים ספציפיים לרקמות ולמטופלים, מערכת זו יכולה לשמש לבדיקת תרופות, רפואה מותאמת אישית ובדיקות רעילות. מודל HASMC-OOC זה מספק פלטפורמה חדשנית במבחנה לחקר הפתוגנזה של מחלת אבי העורקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות אבי העורקים האנושיות נוצלו לבידוד ראשוני של HASMC באישור בית החולים ז'ונגשאן, ועדת האתיקה של אוניברסיטת פודאן (NO. B2020-158). דגימות אבי העורקים נאספו מחולים שעברו ניתוח אבי העורקים בבית החולים ז'ונגשאן, אוניברסיטת פודאן. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני ההשתתפות.
1. בידוד תאי שריר חלק אבי העורקים האנושי העיקרי
- לשטוף את האזור הצדדי הימני של אבי העורקים העולה עם PBS סטרילי, 1x-2x.
- הסר את שכבות האינטימה והאדוונטיטיה של הרקמה עם שני מלקחיים אופתלמיים ולשמור על שכבת המדיה כדי לקצור את התאים.
- מניחים את שכבת המדיה על צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ וחותכים אותה לחתיכות קטנות (2-3 מ"מ) בעזרת מספריים. הוסף 5 מ"ל של תרבית תאי שריר חלק (SMCM) המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
- מעבירים את הרקמה הקטנה לבקבוק התרבית עם טפטפת סטרילית, ומפזרים את הרקמה באופן שווה. השליכו את מדיום התרבית ככל האפשר, ואז הפכו את הבקבוק הפוך.
- הוסיפו 2 מ"ל של SMCM לבקבוק התרבית ההפוך והכניסו אותו לחממה (5% CO 2) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות, ואז סובבו אותו באיטיות לצד ימין למעלה והוסיפו עוד2 מ"ל של SMCM.
- לאחר 5-7 ימים של דגירה, להחליף את SMCM עם 4 מ"ל של SMCM טרי. באופן כללי, תאי שריר חלקים ספורדיים מטפסים החוצה תוך כשבועיים.
- השליכו באיטיות את ה-SMCM והוסיפו אותו באיטיות בעת החלפת המדיום. להעביר את בקבוק התרבית באיטיות בעת מעבר לתחנת מיקרוסקופ; אחרת, הרקמות יצופו, והתאים יגדלו לאט.
- כאשר התאים מגיעים לכ-80% מפגש, יש לשטוף עם 2 מ"ל של PBS, לעכל עם 2 מ"ל של 0.25% טריפסין, ולחלק אותם לשני בקבוקי תרבית חדשים עם 4 מ"ל של SMCM טרי.
- זהה את התאים באמצעות ניתוח אימונופלואורסצנטי של ארבעה סמנים ספציפיים שונים לתאי שריר חלק (CNN1, SM22)14.
2. הכנת שבב PDMS
- כדי להתפלמר PDMS, הוסף חומר ריפוי (רכיב B) לבסיס (רכיב A) ביחס משקל של A: B = 10:1 w/w וערבב את הקומפלקס לחלוטין במשך 5 דקות; הנפח תלוי בצורך של המחקר.
- מניחים את ג'ל PDMS המוכן במיכל מיצוי ואקום למשך 30-60 דקות ושומרים על הלחץ מתחת ל-0.8 mPa.
הערה: לחץ גבוה יוביל למיצוי לא מספיק של בועות קטנות בתוך ג'ל PDMS שישפיע על השלב הבא של ייצור השבבים. - באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD), תכנן את התבנית עם מבנה מסגרת חיצונית של 100 מ"מ × 40 מ"מ × 8 מ"מ ותעלה של 70 מ"מ × 6 מ"מ × 4 מ"מ.
- הכינו בהתאמה אישית את התבניות של שלוש השכבות באמצעות מכונת חריטה ממוחשבת בעלת בקרה נומרית ברמת דיוק גבוהה. גלפו את מסגרת התבניות והמיקרו-ערוצים באמצעות לוחות פולימתיל מתקרילט (PMMA), ולאחר מכן הדביקו אותם על צלחת PMMA אחרת.
- יוצקים את ג'ל PDMS מוכן על תבנית עם 100 מ"מ × 40 מ"מ × מסגרת חיצונית 6 מ"מ ו 70 מ"מ × 6 מ"מ × ערוץ 4 מ"מ, ולאחר מכן להצליב ב 70 °C במשך 1-2 שעות.
- יש לקלף את לוחות ה-PDMS הצולבים מהתבנית ולחתוך את ממברנות ה-PDMS הממוסחרות למקטעים של 100 מ"מ × 40 מ"מ.
- טפלו בשלושת לוחות ה-PDMS שהוכנו ובשני ממברנות PDMS באמצעות פלזמת חמצן למשך 5 דקות להפעלת פני השטח של PDMS. החל את ההגדרות הספציפיות הבאות: אוויר החדר כגז התהליך; לחץ מוגדר ל -100 kPa; הנוכחי מוגדר ל 180--200 Ma; מתח מוגדר ל 200 V; זמן תהליך עד 5 דקות.
- נקב חורים בשלושת לוחות PDMS באמצעות מנקב חורים בקוטר 1 מ"מ כדי ליצור את הכניסה והיציאה של האוויר ומיקרו-ערוצים בינוניים בשבב PDMS.
- חברו שלושה לוחות PDMS ושני ממברנות PDMS יחד לפי הסדר: לוח PDMS של ערוץ אוויר (שכבה עליונה) - קרום PDMS - לוח PDMS של ערוץ בינוני (שכבה אמצעית) - ממברנת PDMS - לוח PDMS של ערוץ אוויר (שכבה תחתונה). בצע שלב זה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי ב-4x כדי לחפוף באופן מלא את המיקרו-ערוצים של האוויר עם המיקרו-ערוצים הבינוניים.
- מניחים את שבב PDMS המורכב באינקובטור של 70 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
- הכינו מספר צינורות לטקס בקוטר פנימי של 1 מ"מ ובאורך 3 ס"מ. הכנס מחט נירוסטה בקוטר חיצוני של 1 מ"מ ובאורך 1 ס"מ לקצה אחד של הצינור המוכן, ולאחר מכן הכנס Luer לקצה השני של הצינור כדי ליצור את הצינור המחובר לאוויר ולמיקרו-ערוצים בינוניים של שבב PDMS.
- הכנס את הצינורות המוכנים לתוך שקעים וכניסות של האוויר ומיקרו-ערוצים בינוניים על שבב PDMS.
3. טיפול משטח שבב PDMS ועיקור
- יש להחדיר 2 מ"ל של קולגן עכברי 80 מ"ג/מ"ל למיקרו-ערוץ הבינוני של שבב PDMS באמצעות מזרק של 2 מ"ל ולדגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- לאחר הדגירה, להסיר את הקולגן מן הערוץ להיזכר עם מזרק 2 מ"ל. הניחו את שבבי ה-PDMS המצופים בקולגן באינקובטור של 60°C למשך הלילה.
- הניחו את שבבי ה-PDMS במעקר UV למשך יותר משעה. הניחו את שבבי ה-PDMS המעוקרים על ספסל אולטרה-נקי כהכנה לניסוי בתא.
4. זריעת תאים על שבב PDMS ותהליך מתיחת תאים
- תרבית 4 x 10 5 תאי שריר חלק אנושיים ראשוניים (HASMCs) מחולים המשתמשים במדיום תאי שריר חלק (SMCM) המכילים 2% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין באינקובטור5 % CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- כאשר צפיפות HASMC מגיע 80%, להשליך את SMCM ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל של PBS.
- לעכל את התאים באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 2 דקות צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו להשעות את גלולת התא ב 1 מ"ל של SMCM טרי. השתמש ב-8 מ"ל של SMCM כדי לתרבת את התאים על צלחת תרבית בגודל 10 ס"מ.
- חשב את מספר התא באמצעות ציטומטר והשתמש בתאים בריכוז סופי של 2 x 105 תאים למ"ל.
- יש לשפוך באיטיות 2 מ"ל של PBS לתוך שבב PDMS בינוני מצופה קולגן ומעוקר, ולאחר מכן להשליך באמצעות מזרק של 2 מ"ל.
- יש לשפוך באיטיות סך של 2 מ"ל של 2 x 105 תאים / מ"ל HASMC ההשעיה לתוך המיקרו-ערוץ הבינוני של שבב PDMS באמצעות מזרק 2 מ"ל. לאחר מכן, סגור את Luer בכניסה ויציאה של שבב PDMS. מניחים את שבב PDMS באינקובטור (5% CO2) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד.
- לאחר שהתאים מחוברים לממברנת PDMS בשבב PDMS, כמעט לאחר 24 שעות, חבר את יציאת המיקרו-ערוץ האוויר בשבב PDMS למערכת בקר הוואקום. כאשר התא מחובר, ניתן לראות מתחת למיקרוסקופ צורה תאית מוארכת ונורמלית, בניגוד לתאים העגולים המרחפים.
- הפעל את שסתום הסולנואיד ואת משאבת הוואקום. פתחו את וסת הוואקום והתאימו את רמת הלחץ ל-10 kPa עבור זן של 7.18 ± 0.44% ו-15 kPa עבור זן של 17.28 ± 0.91%.
- לאחר הגדרת הפרמטרים של מערכת הבקרה, מניחים את שבבי PDMS באינקובטור (5% CO2) ב 37 °C ומותחים במשך 24 שעות.
5. הכנת מערכת הבקרה המכנית
- הכן מספר שסתומי סולנואיד, מסנני ואקום, וסתי ואקום, משאבת ואקום, משאבה פריסטלטית ובקר לוגי ניתן לתכנות (PLC) השולט בשסתום הסולנואיד.
- תכנת את בקר ה- PLC והגדר את מרווח זמן ההפעלה/כיבוי ל- 1 Hz. חבר את שסתומי הסולנואיד לבקר המתוכנת.
- חבר את כניסת משאבת הוואקום למסנני הוואקום ולאחר מכן חבר את השקע של מסנני הוואקום לווסתי הוואקום. חבר את השקע של וסתי הוואקום לשסתומי סולנואיד, ולבסוף, חבר את השקע של שסתומי הסולנואיד לשקעים של מיקרו-ערוצי האוויר של שבבי PDMS.
- חבר את היציאה של המשאבה הפריסטלטית לכניסה של המיקרו-ערוץ הבינוני של שבב PDMS ואת הכניסה של המשאבה הפריסטלטית לשקע של שבב PDMS מיקרו-ערוצי בינוני להחלפת תרבית בינונית וטיפול בתרופות.
- התאם את המשרעת של המתח על ידי הרגולטור ואת תדר המתח על ידי המיקרו-בקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל HASMC-OOC מורכב ממערכת בקרת ואקום, מערכת מחזור ושבבי PDMS, והתכנון הסכמטי של מודל HASMC-OOC (איור 1). מערכת בקרת הוואקום מורכבת ממשאבת ואקום, שסתומי סולנואיד ובקר PLC. כדי לפעול כמערכת המחזור, נעשה שימוש במשאבה פריסטלטית כדי לרענן את מדיום תרבית התאים ולהוסיף תרופות. שבב ה-PDMS הורכב משני תאי ואקום ותא אמצעי מלא ב-SMCM לצמיחת תאים. על פי התכנון של מבנה השבב, תבנית PMMA הוכנה, ושלושת לוחות PDMS הוכנו על ידי מזיגה לתוך תבניות וקישור צולב ב 70 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות. לאחר טיפול בפלזמה, שלושת לוחות ה-PDMS ושני ממברנות ה-PDMS חוברו זה לזה (איור 2). כאשר שבבי ה-PDMS הוכנו, ה-HASMCs גודלו בתרבית על קרום ה-PDMS שבשב, ושבבי ה-PDMS חוברו למערכת בקרת הוואקום ולמערכת המחזור. שרטוט של המערכת כולה מוצג באיור משלים 1. הפרמטרים של שבב PDMS מוצגים באיור 3A, והתכונות המכניות של קרום PDMS מוצגות באיור 3B. כדי לכמת את זני המתיחה של קרום ה-PDMS, תפסנו את העיוותים בזמן אמת של ממברנות ה-PDMS ממבט חתך של המודל המיקרופלואידי, עם לחצי ואקום של 0 kPa, 10 kPa, 15 kPa, 20 kPa, 25 kPa ו-30 kPa. מדדנו גם את השינויים באורך כדי להעריך את גודל המתח של קרום PDMS ברוחבי תעלות גידול שונים של 2 מ"מ, 4 מ"מ ו-6 מ"מ (איור 3C-E). מיקרו-ערוצים ברוחב 6 מ"מ שימשו בשבב PDMS. התוצאות הראו כי לחץ ואקום של 10 kPa גרם לזן של 7.18 ± 0.44% ו-15 kPa גרם לזן של 17.28 ± 0.91% (איור 3E).
כדי לאמת את כדאיות התאים של קו תאי HASMC (CRL1999) בשבב PDMS, בוצעה בדיקת LIVE/DEAD בימים 3 ו-5 לאחר שהתאים עברו תרבית. התוצאות הראו כי כדאיות התאים הייתה גבוהה מ-90% ביום 3 וביום 5 (איור 4A). צביעת שלד ציטוסקוזי (F-actin) של CRL1999 בשבב PDMS הראתה מורפולוגיה תקינה של תאים ותאים מיושרים בניצב לזן לאחר מתיחה במשך 24 שעות (איור 4B-C). צביעה אימונופלואורסצנטית של סמני ההתכווצות SM22 ו-CNN1 בוצעה באמצעות HASMC-OOC לאחר 24 שעות של מאמץ קצבי (איור 4D-E). כדי להתחיל, 2 מ"ל של PBS נשפך לאט לתוך הערוץ והושלך עם מזרק 2 מ"ל. לאחר מכן, 2 מ"ל של 4% (v / v) paraformaldehyde נשפך לתוך הערוץ דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, 2 מ"ל של 0.2% (v / v) Triton X-100 נשפך לתוך הערוץ על ידי מזרק 2 מ"ל דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. זה היה ואחריו 2 מ"ל של PBS נשפך לאט לתוך הערוץ והושלך על ידי מזרק 2 מ"ל לאחר שטיפת התאים. לאחר מכן, 2 מ"ל של 5% (w / v) אלבומין בסרום בקר נשפך לאט לתוך הערוץ ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, 1 מ"ל של נוגדן SM22 או CNN1 נשפך לאט לתוך הערוץ ודגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, 1 מ"ל של נוגדן משני נגד ארנב עז נשפך לאט לתוך הערוץ דגירה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר. לבסוף, 1 מ"ל של תמיסת DAPI נשפך לאט לתוך הערוץ ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. התוצאות הראו שעוצמת הפלואורסצנטיות של SM22 ו-CNN1 בתנאי מאמץ הייתה גבוהה מזו של תנאים סטטיים (איור 4F). בהשוואה לתנאים סטטיים, הגנים SM22 ו-CNN1 ב-HASMCs היו מווסתים בתנאי מאמץ (איור 4G). נתונים אלה הצביעו על כך ש-CRL1999 התיישר בניצב לכיוון המתח וכי פנוטיפ מתכווץ בולט יותר בתנאי מאמץ מאשר בהתרבות תאים קונבנציונלית בתנאים סטטיים.
תוך שימוש ב-TAAD (BAV-TAAD) הקשור למסתם אבי העורקים ו-TAAD (TAV-TAAD) הקשור למסתם אבי העורקים טריקוספיד שמקורו בחולי HASMCs, הקמנו מודלים של מחלות BAV-TAAD ו-TAV-TAAD. התוצאות של צביעת F-actin של BAV-TAAD ו-TAV-TAAD של HASMCs ראשוניים שמקורם בחולה הראו מורפולוגיה תקינה של תאים ותאים מיושרים בניצב לכיוון המתח לאחר מתיחה במשך 24 שעות (איור 5A-B). צביעת אימונופלואורסצנציה הראתה שביטוי SM22 ו-CNN1 ב-BAV-TAAD וב-TAV-TAAD של HASMCs ראשוניים שמקורם בחולים היה גבוה יותר בתנאי מאמץ מאשר בתנאים סטטיים (איור 5C-G,I). רמות ביטוי הגנים של SM22 ו-CNN1 ב-BAV-TAAD וב-TAV-TAAD שמקורם ב-HASMCs ראשוניים שמקורם בחולים היו מווסתות בתנאי מאמץ לעומת תנאים סטטיים (איור 5H,J). תוצאות אלה ב- BAV-TAAD ו- TAV-TAAD HASMCs ראשוניים שמקורם בחולה בשבב PDMS היו עקביות עם התוצאות מקו התאים של HASMC CRL1999, מה שמצביע על כך שהשילוב של HASMCs ראשוניים שמקורם בחולה ומודל HASMC-OOC משכפלים את מאפייני HASMC ב- TAAD, המספק מודל BAV-TAAD ו- TAV-TAAD במבחנה להמשך חקירה של המנגנונים המולקולריים של המחלה ובדיקת תרופות.
איור 1: תכנון סכמטי של מערכת HASMC-OOC. המערכת מורכבת ממערכת בקרת ואקום, מערכת מחזור ושבבי PDMS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הליך הכנת שבב PDMS. ג'ל PDMS נשפך לתוך תבנית PMMA והצטלב ב 70 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות. לאחר מכן, שלושת לוחות ה-PDMS ושני ממברנות ה-PDMS טופלו בפלזמה במשך 5 דקות וחוברו יחדיו. לבסוף, שבבי PDMS מוכנים עברו עיקור, וריכוז של 2 x 105 תאים / מ"ל HASMC הוזרם באיטיות לתוך המיקרו-ערוץ הבינוני של שבב PDMS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הפרמטרים המפורטים והתכונות המכניות של שבב PDMS. (A) הפרמטרים המפורטים של שבב PDMS. גודל לוח PDMS היה 100 מ"מ × 40 מ"מ × 6 מ"מ, וגודל המיקרו-ערוץ היה 70 מ"מ × 6 מ"מ × 4 מ"מ. (B) הפרמטרים של קרום PDMS מסחרי. משרעת המתיחה המחושבת של קרום PDMS בלחצי ואקום שונים לרוחב מיקרו-ערוצים של 2 מ"מ (C), 4 מ"מ (D) ו-6 מ"מ (E). הנתונים מראים סטיית תקן ממוצעת ± (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: מורפולוגיה של תאים, התמצאות ושינוי פנוטיפ של HASMCs בתנאי מאמץ מחזורי. (A) תמונה מייצגת של בדיקת LIVE/DEAD ביום 3 וביום 5 לאחר קו התאים HASMC (CRL1999) על שבב PDMS. (B) צביעת F-אקטין של CRL1999 בתנאים סטטיים ומתאמץ. (C) כיוון התא של CRL1999 בתנאים סטטיים ומתוחים. תמונה מייצגת של צביעת אימונופלואורסצנציה של SM22 (D) ו- CNN1 (E) ב- CRL1999 בתנאים סטטיים ומתח. (F) העוצמה היחסית של צביעת אימונופלואורסצנציה של SM22 ו- CNN1. (G) ביטוי SM22 ו-CNN1 mRNA ב-CRL1999 בתנאים סטטיים ומתוחים. n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, מבחני t של סטודנט דו-זנב שימשו להשוואה בין שתי הקבוצות. הנתונים מראים ממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: מורפולוגיה של תאים ושינויים פנוטיפיים ב-BAV-TAAD וב-HASMC-OOC שמקורו בחולי TAV-TAAD. תמונה מייצגת של צביעת F-actin של HASMCs ראשוניים שמקורם ב-BAV-TAAD (A) ו-TAV-TAAD (B)-HASMCs ראשוניים הנגזרים בתנאים סטטיים ומתח. צביעת אימונופלואורסצנציה SM22 ב-HASMCs ראשוניים שמקורם ב-BAV-TAAD (C) וב-HASMCs ראשוניים שמקורם ב-TAV-TAAD (D) בתנאים סטטיים ומתוחים. תמונה מייצגת של צביעת אימונופלואורסצנציה של CNN1 ב-HASMCs ראשוניים שמקורם ב-BAV-TAAD (E) וב-HASMCs ראשוניים הנגזרים מ-TAV-TAAD (F) בתנאים סטטיים ומתאמץ. (G) העוצמה היחסית של הכתמה אימונופלואורסצנטית SM22 ו-CNN1 ב-HASMCs ראשוניים שמקורם ב-BAV-TAAD. (H) ביטוי SM22 ו-CNN1 mRNA ב-HASMCs ראשוניים שמקורם ב-BAV-TAAD בתנאים סטטיים ומתוחים. (I) העוצמה היחסית של צביעת אימונופלואורסצנציה SM22 ו-CNN1 ב-HASMCs ראשוניים שמקורם ב-TAV-TAAD. (J) ביטוי SM22 ו-CNN1 mRNA ב-HASMCs ראשוניים שמקורם ב-TAV-TAAD בתנאים סטטיים ומתוחים. n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, מבחני t של סטודנט דו-זנבי שימשו להשוואה בין שתי הקבוצות. הנתונים מראים ממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: הוראה סכמטית של הכנת ציוד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם ההתפתחות המהירה של טכנולוגיה מיקרופלואידית, מודלים של OOC שיכולים לשכפל את התפקוד הביולוגי והמבנה של איבר אחד או יותר במבחנה התפתחו בשנים האחרונות ליישומים בביולוגיה, רפואה ופרמקולוגיה15. OOC יכול לדמות תפקודים מרכזיים של המיקרו-סביבה הפיזיולוגית האנושית, החיוניים לחקר מנגנוני מחלה ולקידום תרגום תרופות פרה-קליניות 8,16. למרות ש- OOC עדיין נמצא בשלבים המוקדמים ויש צורך בקלט נוסף כדי לייעל את העיצוב של OOC, התקדמות רבה הושגה בשנים האחרונות17,18. שלא כמו מודלים תלת-ממדיים אחרים של תרביות תאים, OOC יכול לחקות את הפרמטרים הביומכניים של גוף האדם החיוניים להתפתחות רקמות ולשמירה על תפקוד האיברים. איברים ורקמות של מערכת הלב וכלי הדם נתונים כל הזמן גזירה הנגרמת על ידי זרימת נוזלים ומתח מחזורי in vivo. לכן, ניסויים תאיים במבחנה של מערכת הלב וכלי הדם צריכים להתבצע בפלטפורמה ניסיונית המספקת פרמטרים ביומכניים כאלה כדי לקבל תוצאות ניסוי מציאותיות דומות לאלה המתקבלות ממחקרי in vivo.
במחקר זה, הקמנו HASMC-OOC שיכול לשלוט במדויק בפרמטרים של הזן הביומכני שאליו HASMCs נתונים. ניתן לשלוט במהירות הנוזל ובגזירה הנוזלית שאליה נתונים התאים, וכן לשלוט במדויק על המשרעת, התדירות והקצב של תבניות שונות של מתח מחזורי. מבין החומרים הרבים ששימשו בתחום OOC, PDMS הוא אחד הנפוצים ביותרשאומצו 19,20,21. PDMS הוא שקוף, גמיש, תואם ביולוגית ונושם, ותכונות אלה תורמות לשימוש נרחב בו בתחום השבבים המיקרופלואידיים19. שינויי לחץ המופעלים יכולים לעוות את PDMS כדי להשיג את הכוח המכני של התכווצות והרפיה, והחדירות של PDMS מבטיחה שסביבת תרבית התאים על השבב יכולה להיות עקבית עם תנאי הדגירה של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור. לכן, PDMS לא רק מספק כוח מכני מבוקר לתאים, אלא גם מספק סביבת תרבית המתאימה לצמיחת תאים תקינה. תוצאות הניסוי שלנו מראות כי המורפולוגיה והפעילות של תאים בתרבית בשבב PDMS עולות בקנה אחד עם תנאי תרבית דו-ממדית, מה שמצביע על כך ש-PDMS תואם ביולוגית.
בתנאים פיזיולוגיים ביומימטיים in vivo , HASMCs בדופן אבי העורקים נתונים למתח מחזורי של כ-9%22. בתנאים פתולוגיים, כגון יתר לחץ דם, התרחבות אבי העורקים ומפרצת אבי העורקים, HASMCs נתונים למתח מחזורי גדול מ-16%23. אפיינו את תכונות המתיחה של שבב PDMS, ותוצאות הניסוי מראות כי לחץ ואקום של 10 kPa גרם לזן של 7.18 ± 0.44% ו-15 kPa גרם לזן של 17.28 ± 0.91%. בנוסף, ניתן לשלוט בתדירות המתח ולחץ הגזירה הנוזלי על ידי מערכת שבב PDMS זו. באמצעות BAV-TAAD ו- TAV-TAAD שמקורם ב- HASMCs ראשוניים שמקורם בחולה, המנגנונים המולקולריים ובדיקת התרופות של מחלות אבי העורקים הללו יכולים להתבצע באמצעות מודל HASMC-OOC in vitro זה, אשר יכול לשכפל את פתוגנזה המחלה של מחלות אבי העורקים השונות. באמצעות מערכת זו, הקמנו מודל מחלה כדי לחקור את הפתוגנזה של BAV-TAAD וגילינו כי מפעיל איחוי מיטוכונדריאלי יכול להציל חלקית את תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בתאים חולים24.
ה- HASMC-OOC תוכנן על סמך ההשראה וההתייחסות של ריאות על שבב מעבודתו של אינגבר9. המכשיר שלהם שכפל תנועות נשימה פיזיולוגיות של הנאדיות בריאה, והשבב כלל שלוש שכבות: ערוצים בינוניים עליונים ותחתונים, קרום PDMS נקבובי ושני תאי ואקום צדדיים. תאי ואקום צדדיים יכולים להתבצע רק במעבדות מיוחדות עם ציוד מיקרופלואידי מתקדם. כדי לאפשר הרכבה בתנאי מעבדה כלליים יותר, מיקמנו את תאי הוואקום בחלק העליון והתחתון של השבב. לשתי גישות המתיחה יש תפקידים דומים, כך שניתן לבחור את מבנה השבב בהתאם לתנאי המעבדה ולצרכי המחקר כך שייבחרו. בנוסף, כדי לבסס מבנית את המבנה הצינורי של אבי העורקים האנושי ולקבל דגימות ביולוגיות נוספות מהתאים לביצוע אנליזה ביולוגית מורכבת נוספת ומבחני ניסוי, הקמנו שבב PDMS בעל חמש שכבות עם ערוצים גדולים יותר, שהורכב מערוץ בינוני אמצעי, שני ממברנות PDMS ותאי ואקום עליונים ותחתונים. שני ממברנות PDMS והתעלות הגדולות של שבב PDMS הגדילו את שטח תרבית התא עד 8.4 ס"מ2, וסיפקו מספיק דגימות לניתוח חלבונים. הפלטפורמות שדווחו בעבר התמקדו בעיקר בחקר מחלות עורקים קלות, כגון עורק מוחי, כלי היקפי או מחלות עורקים אחרות25,26. אבי העורקים הוא כלי גדול בקוטר של 25-35 מ"מ, ואמצעי הטוניקה של אבי העורקים מורכב בעיקר מתאי שריר חלקים הנתונים למתח מתיחה גבוה. הפתולוגיה של אבי העורקים קשורה לשיפוץ דופן אבי העורקים, אפופטוזיס של תאי שריר חלקים ומיתוג פנוטיפי, שכולם יכולים להיות מוסדרים על ידי לחץ מכני. לפיכך, HASMCs שמקורם בחולה וזן מתיחה הם מרכיבים חיוניים להצלחת HASMC-OOC. עם זאת, יש כמה מגבלות למחקר זה. HASMC-OOC לא השתמש בתאי כלי דם שעברו כריתת קולטורציה, כולל HASMCs, תאי אנדותל אבי העורקים ופיברובלסטים, שעשויים לדמות טוב יותר את המיקרו-סביבה in vivo של אבי העורקים האנושי, וניתן להשתמש בהם כדי לחקור את האינטראקציה בין תאים אלה. למרות ש-HASMCs חווים מאמץ קצבי, התאים עדיין מתרבית על קרום PDMS שטוח שאינו מצליח לחקות את המטריצה החוץ-תאית. במחקרים עתידיים, נתגבר על מגבלות אלה על ידי שילוב שבבים מיקרופלואידיים עם טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מכירים בכך שעבודה זו נתמכה על ידי מענקים מוועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי (20ZR1411700), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81771971) ותוכנית השייט של שנגחאי (22YF1406600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
