大動脈壁における生体力学的ひずみを再現するためのヒト大動脈平滑筋細胞器官チップモデルの構築
Summary
ここでは、ヒト大動脈壁の平滑筋細胞の in vivo 生体力学的ひずみを再現するためのヒト大動脈平滑筋細胞臓器オンチップモデルを開発しました。
Abstract
従来の二次元細胞培養技術および動物モデルは、ヒト胸部大動脈瘤および解離(TAAD)の研究に使用されてきた。しかし、ヒトTAADは動物モデルによって特徴付けられないことがある。臨床ヒト試験と動物実験の間には、治療薬の発見を妨げる可能性のある明らかな種のギャップがあります。対照的に、従来の細胞培養モデルは、 in vivo の生体力学的刺激をシミュレートすることができません。この目的のために、微細加工およびマイクロ流体技術は近年大きく発展しており、生体力学的微小環境を再現するオルガノイドオンチップモデルを確立するための新しい技術を提供しています。本研究では、ヒト大動脈平滑筋細胞オルガンオンチップ(HASMC-OOC)モデルを開発し、TAADで重要な役割を果たすヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC)が経験する周期的ひずみの振幅と頻度を含む、大動脈バイオメカニクスの病態生理学的パラメータをシミュレートしました。このモデルでは、HASMCの形態は形状が細長く、ひずみ方向に対して垂直に整列し、静的な従来の条件下よりもひずみ条件下でより収縮的な表現型を示しました。これは、天然のヒト大動脈壁における細胞の配向および表現型と一致していた。さらに、二尖弁大動脈弁関連TAAD(BAV-TAAD)および三尖弁大動脈弁関連TAAD(TAV-TAAD)患者由来の原発性HASMCを用いて、TAADのHASMC特性を再現するBAV-TAADおよびTAV-TAAD疾患モデルを確立しました。HASMC-OOCモデルは、TAADの病因をさらに探索し、治療標的を発見するための動物モデルを補完する新しい in vitro プラットフォームを提供します。
Introduction
胸部大動脈瘤および解離(TAAD)は、高い罹患率および死亡率に関連する大動脈壁の局所的な拡張または層間剥離です1。ヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC)は、TAADの病因において重要な役割を果たしています。HASMCは終末分化細胞ではなく、HASMCは高い可塑性を保持しているため、異なる刺激に応答して表現型を切り替えることができます2。HASMCは主に生体内でリズミカルな引張ひずみを受けており、これは平滑筋の形態学的変化、分化および生理学的機能を調節する重要な因子の1つです3,4。したがって、HASMCの研究における周期的ひずみの役割は無視できません。しかし、従来の2D細胞培養では、HASMCが経験する環状株の生体力学的刺激をin vivoで再現することはできません。さらに、動物TAADモデルの構築は、二尖大動脈弁(BAV)関連のTAADなど、一部のタイプのTAADには適していません。さらに、臨床ヒト研究と動物実験の間の種のギャップは無視できません。それは臨床現場での医薬品翻訳を妨げます。したがって、大動脈疾患の研究において、in vivo生体力学的環境をシミュレートするためのより複雑で生理学的なシステムが緊急に必要とされています。
生物医学研究や医薬品開発に使用される動物実験は、費用と時間がかかり、倫理的に疑わしいものです。さらに、動物実験の結果は、ヒト臨床試験で得られた結果を予測できないことがよくあります5,6。ヒトの前臨床モデルの欠如と臨床試験における高い失敗率により、診療所に有効な薬剤がほとんどなく、医療費が増加しています7。したがって、動物モデルを補完する他の実験モデルを見つけることが急務です。微細加工およびマイクロ流体技術は近年大きく発展しており、従来の2D細胞培養技術の欠点を改善し、生理学的研究および医薬品開発のためのより現実的で低コストかつ効率的なin vitroモデルを確立するためのオルガノイドオンチップモデルを確立するための新しい技術を提供しています。マイクロ流体デバイスを使用して、組織または臓器の主要な機能を再現するために、異なる刺激を持つマイクロメートルサイズのチャンバーで生細胞を培養するための臓器オンチップが確立されます。このシステムは、単一または複数のマイクロ流体マイクロチャネルで構成されており、灌流チャンバーで培養された1種類の細胞が1つの組織タイプの機能を複製するか、異なる細胞タイプを多孔質膜上で培養して異なる組織間の界面を再現します。マイクロ流体ベースのオルガノイドと患者由来の細胞を組み合わせると、マウスとヒトの疾患モデル間の大きな種の違いを橋渡しし、疾患メカニズムの研究や創薬のための従来の2D細胞培養の欠点を克服するという独自の利点があります。過去数年間のマイクロフルイディクスの急速な発展に伴い、研究者は複雑なin vivo生物学的パラメータを複製するin vitro臓器オンチップ(OOC)モデルの有用性を認識しました8。これらのマイクロ流体オルガノイドは、周期的なひずみ、せん断応力、液圧などのin vitro生体力学的環境をシミュレートし、3次元(3D)細胞培養環境を提供します。現在までに、肺9、腎臓10、肝臓11、腸12、心臓13などの臓器の生体力学的刺激をシミュレートするためのOOCモデルがいくつか確立されていますが、これらはヒト大動脈疾患の研究に広く適用されていません。
本研究では、TAAD患者由来の初代HASMCに適用される生体模倣的な機械的力とリズムを制御できるヒト大動脈平滑筋細胞オルガンオンチップ(HASMC-OOC)モデルを紹介します。このチップは、チャネルでエッチングされたポリジメチルシロキサン(PDMS)の3層の厚板と、2つの商品化された柔軟性の高いPDMS膜で構成されています。HASMCはPDMSメンブレン上で培養されます。チップの中央にあるチャネルは、細胞培養用の培養液で満たされています。チップの上部と下部のチャネルは、PDMS膜の機械的引張ひずみのリズムと周波数を制御できる真空圧力供給システムに接続されています。HASMCが経験するリズムのひずみをHASMC-OOCでシミュレートすることができ、従来の2D培養システムでは機能的に達成できなかった組織または臓器の生体力学的微小環境を再現します。高解像度、リアルタイムイメージング、および生体力学的微小環境の利点により、生細胞の生化学的、遺伝的、代謝的活動を組織発生、臓器生理学、疾患病因、分子メカニズムおよびバイオマーカー同定、心血管疾患および大動脈疾患について研究することができる。組織特異的および患者細胞と組み合わせることで、このシステムは薬物スクリーニング、個別化医療、および毒性試験に使用できます。このHASMC-OOCモデルは、大動脈疾患の病因を研究するための新しい in vitro プラットフォームを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
マイクロ流体技術の急速な発展に伴い、生物学、医学、薬理学への応用のために、1つまたは複数の臓器の生物学的機能と構造をin vitroで再現できるOOCモデルが近年登場しています15。OOCは、疾患メカニズムの探索と前臨床薬物翻訳の促進に不可欠な、ヒトの生理学的微小環境の主要な機能をシミュレートすることができます8,16</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この研究が上海市科学技術委員会(20ZR1411700)、中国国家自然科学財団(81771971)、上海セーリングプログラム(22YF1406600)からの助成金によって支援されたことを認めている。
Materials
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow – application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
