Embryoinjektionsteknik til genredigering i den sortbenede flåt, Ixodes scapularis
Summary
Den nuværende protokol beskriver en metode til injektion af flåtembryoner. Embryoinjektion er den foretrukne teknik til genetisk manipulation til at generere transgene linjer.
Abstract
Flåter kan overføre forskellige virale, bakterielle og protozoiske patogener og betragtes derfor som vektorer af medicinsk og veterinær betydning. På trods af den voksende byrde af flåtbårne sygdomme har forskning i flåter haltet bagefter insektsygdomsvektorer på grund af udfordringer med at anvende genetiske transformationsværktøjer til funktionelle undersøgelser til flåternes unikke biologi. Genetiske indgreb har fået opmærksomhed for at reducere myggebårne sygdomme. Udviklingen af sådanne interventioner kræver imidlertid stabil kimlinjetransformation ved at injicere embryoner. En sådan embryoinjektionsteknik mangler for chelicerater, herunder flåter. Flere faktorer, såsom et eksternt tykt vokslag på flåtembryoner, hård chorion og højt intra-ovalt tryk, er nogle forhindringer, der tidligere forhindrede embryoinjektionsprotokoludvikling i flåter. Det nuværende arbejde har overvundet disse forhindringer, og en embryoinjektionsteknik til den sortbenede flåt, Ixodes scapularis, er beskrevet her. Denne teknik kan bruges til at levere komponenter, såsom CRISPR/Cas9, til stabile kimlinjetransformationer.
Introduction
Flåter er vektorer af medicinsk og veterinær betydning, der er i stand til at overføre en række virale, bakterielle, protozopatogener og nematoder 1,2. I det østlige USA er den sortbenede flåt, Ixodes scapularis, en vigtig vektor af Lyme-sygdommen (LD) patogenet, spirochete Borrelia burgdorferi. Over 400.000 tilfælde af LD rapporteres hvert år i USA, hvilket gør det til den øverste vektorbårne infektionssygdom i USA1. Ud over B. burgdorferi overføres seks andre mikroorganismer af I. scapularis– herunder fire bakterier (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi og Ehrlichia muris eauclarensis), en protozoparasit (Babesia microti) og en virus (Powassan-virus), hvilket gør denne flåtart til et stort folkesundhedsproblem3 . Mens flåtbårne sygdomme er blevet mere udbredte i de senere år, er forskning i flåter faldet bag andre leddyrvektorer, såsom myg, på grund af flåternes unikke biologi og udfordringer forbundet med anvendelse af genetiske og funktionelle genomiske værktøjer 4,5.
Genredigeringsteknikker, især CRISPR/Cas9, har nu gjort funktionelle genomforskningsstudier mulige i organismer uden for modellen. For at skabe arvelige mutationer i en organisme forbliver embryoinjektion den foretrukne metode til at levere konstruktioner til ændring af kimlinjen 6,7,8,9. Indtil for nylig 4 blev flåtæg imidlertid betragtetsom for vanskelige eller endda umulige at injicere uden at dræbe embryoet10,11. Et tykt vokslag på æg, hård chorion og højt intra-ovalt tryk var nogle af de største forhindringer, der forhindrede embryoinjektion i flåter. Voksen, blodfodret I. scapularis deponerer en enkelt kobling på op til 2.000 æg12 over 3-4 uger (ca. 100 æg / dag). Æg lægges enkeltvis, og hvert æg er belagt med voks, der udskilles af fremspring eller “horn” af kirtelgenéens organ13,14,15 af moderen. Denne voks beskytter æggene mod udtørring og indeholder antimikrobielle forbindelser15. For at kunne injicere krydsæg er det vigtigt at fjerne vokslaget, blødgøre chorionen og udtørre æggene for at mindske det intraovale tryk, så injektionen ikke irreversibelt beskadiger ægget. For at forstå den kritiske betydning af embryoinjektioner for en vellykket kimlinjetransformation udvikles en protokol for I. scapularis, som kan bruges til at levere en CRISPR / Cas9-konstruktion og generere stabile kimlinjemutationer4. Ud over dets bidrag til I. scapularis-forskning kan denne protokol også optimeres til andre flåtarter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette er den første protokol, der er udviklet til at injicere tidlige flåtembryoner med succes. Der er opnået en overlevelsesrate på ~4%-8%, hvilket kan sammenlignes med embryoinjektion i andre veletablerede insektmodeller5.
Da dette er den oprindelige protokol, forventes det, at denne protokol vil blive yderligere raffineret og specialiseret til individuelle flåtarter. Især vil injektionstidspunktet variere fra art til art, afhængigt af embryogenese, især tidsp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Channa Aluvihare og Yonus Gebermicale, ITF, UMD, for indsigt og støtte i den indledende fase af protokoludviklingen. Wolfram nåle var en generøs gave fra David O’Brochta, ITF, UMD. Vi er taknemmelige for Dr. Ladislav Simo for at teste denne protokol i I. ricinus og for indsigtsfulde diskussioner. Dette projekt blev finansieret af NIH-NIAID R21AI128393 og Plymouth Hill Foundation, NY til MG-N, opstartsmidler fra University of Nevada til AN, National Science Foundation Grant No. 2019609 til MG-N og AN og et Peer-to-Peer Grant fra IGTRCN til AS.
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
