Embryoinjektionsteknik för genredigering i den svartbenta fästingen, Ixodes scapularis
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att injicera fästingembryon. Embryoinjektion är den föredragna tekniken för genetisk manipulation för att generera transgena linjer.
Abstract
Fästingar kan överföra olika virala, bakteriella och protozoa patogener och anses därför vara vektorer av medicinsk och veterinär betydelse. Trots den växande bördan av fästingburna sjukdomar har forskningen om fästingar släpat efter insektssjukdomsvektorer på grund av utmaningar med att tillämpa genetiska omvandlingsverktyg för funktionella studier på fästingarnas unika biologi. Genetiska ingrepp har fått uppmärksamhet för att minska myggburna sjukdomar. Utvecklingen av sådana ingrepp kräver emellertid stabil bakterieomvandling genom injektion av embryon. En sådan embryoinjektionsteknik saknas för chelicerat, inklusive fästingar. Flera faktorer, såsom ett yttre tjockt vaxlager på fästingembryon, hård korion och högt intra-ovalt tryck, är några hinder som tidigare förhindrade embryoinjektionsprotokollutveckling hos fästingar. Det aktuella arbetet har övervunnit dessa hinder, och en embryoinjektionsteknik för den svartbenta fästingen, Ixodes scapularis, beskrivs här. Denna teknik kan användas för att leverera komponenter, såsom CRISPR/Cas9, för stabila bakterietransformationer.
Introduction
Fästingar är vektorer av medicinsk och veterinär betydelse, som kan överföra en mängd olika virala, bakteriella, protozoa patogener och nematoder 1,2. I östra USA är den svartbenta fästingen, Ixodes scapularis, en viktig vektor av borreliapatogenen (LD), spiroketen Borrelia burgdorferi. Över 400 000 fall av LD rapporteras varje år i USA, vilket gör det till den främsta vektorburna infektionssjukdomen i USA1. Förutom B. burgdorferi överförs sex andra mikroorganismer av I. scapularis– inklusive fyra bakterier (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi och Ehrlichia muris eauclarensis), en protozo parasit (Babesia microti) och ett virus (Powassan-virus), vilket gör denna fästingart till ett stort folkhälsoproblem3 . Medan fästingburna sjukdomar har blivit vanligare de senaste åren, har forskning om fästingar hamnat efter andra leddjursvektorer, såsom myggor, på grund av fästingarnas unika biologi och utmaningar i samband med tillämpning av genetiska och funktionella genomiska verktyg 4,5.
Genredigeringstekniker, särskilt CRISPR/Cas9, har nu gjort funktionsgenomikstudier möjliga i icke-modellorganismer. För att skapa ärftliga mutationer i en organism förblir embryoinjektion den föredragna metoden för att leverera konstruktioner för att ändra könslinjen 6,7,8,9. Men fram till nyligen4 ansågs fästingägg vara för svåra eller till och med omöjliga att injicera utan att döda embryot10,11. Ett tjockt vaxlager på ägg, hård korion och högt intra-ovalt tryck var några av de största hindren som förhindrade embryoinjektion i fästingar. Vuxen, blodmatad I. scapularis deponerar en enda koppling på upp till 2,000 ägg12 under 3-4 veckor (cirka 100 ägg / dag). Ägg läggs ensamt och varje ägg beläggs med vax som utsöndras av utsprång eller “horn” av körteln Genés organ13,14,15 av modern. Detta vax skyddar äggen från uttorkning och innehåller antimikrobiella föreningar15. För att framgångsrikt injicera fästingägg är det viktigt att ta bort vaxskiktet, mjuka korionen och torka äggen för att minska det intraovala trycket så att injektionen inte irreversibelt skadar ägget. För att förstå den kritiska betydelsen av embryoinjektioner för framgångsrik bakterietransformation utvecklas ett protokoll för I. scapularis, som kan användas för att leverera en CRISPR / Cas9-konstruktion och generera stabila bakteriemutationer4. Förutom dess bidrag till I. scapularis-forskningen kan detta protokoll också optimeras för andra fästingarter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta är det första protokollet som utvecklats för att injicera tidiga fästingembryon framgångsrikt. En överlevnad på ~4%-8% har uppnåtts, vilket är jämförbart med embryoinjektion i andra väletablerade insektsmodeller5.
Eftersom detta är det ursprungliga protokollet förväntas detta protokoll förfinas ytterligare och specialiseras till enskilda fästingarter. I synnerhet kommer injektionstiden att variera från art till art, beroende på embryogenes, sär…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Channa Aluvihare och Yonus Gebermicale, ITF, UMD, för insikt och stöd under den inledande fasen av protokollutveckling. Volframnålar var en generös gåva från David O’Brochta, ITF, UMD. Vi är tacksamma mot Dr. Ladislav Simo för att ha testat detta protokoll i I. ricinus och för insiktsfulla diskussioner. Detta projekt finansierades av NIH-NIAID R21AI128393 och Plymouth Hill Foundation, NY till MG-N, startmedel från University of Nevada till AN, National Science Foundation Grant nr 2019609 till MG-N och AN, och ett Peer-to-Peer-bidrag från IGTRCN till AS.
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
