Untersuchung der mikrobiellen Kooperation mittels bildgebender Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkolonien, die während der Infektion auf Agar und im Gewebe gezüchtet wurden
Summary
Eine neuartige Probenvorbereitungsmethode wird für die Analyse von agarbasierten, bakteriellen Makrokolonien mittels matrixunterstützter Laserdesorptions-/Ionisationsbildgebungs-Massenspektrometrie demonstriert.
Abstract
Das Verständnis der metabolischen Konsequenzen mikrobieller Interaktionen, die während einer Infektion auftreten, stellt eine einzigartige Herausforderung für das Gebiet der biomedizinischen Bildgebung dar. Die Matrix-assistierte Laserdesorptions-/Ionisations-Bildgebungs-Massenspektrometrie (MALDI) stellt eine markierungsfreie In-situ-Bildgebungsmodalität dar, die in der Lage ist, räumliche Karten für eine Vielzahl von Metaboliten zu erstellen. Während dünn geschnittene Gewebeproben heute routinemäßig mit dieser Technologie analysiert werden, bleiben bildgebende Massenspektrometrie-Analysen von nicht-traditionellen Substraten, wie z. B. Bakterienkolonien, die in der mikrobiologischen Forschung üblicherweise auf Agar gezüchtet werden, aufgrund des hohen Wassergehalts und der ungleichmäßigen Topographie dieser Proben eine Herausforderung. In diesem Artikel wird ein Arbeitsablauf zur Probenvorbereitung demonstriert, der bildgebende Massenspektrometrie-Analysen dieser Probentypen ermöglicht. Dieser Prozess wird anhand von bakteriellen Co-Kultur-Makrokolonien zweier gastrointestinaler Krankheitserreger veranschaulicht: Clostridioides difficile und Enterococcus faecalis. Es wird auch gezeigt, dass die Untersuchung mikrobieller Interaktionen in dieser gut definierten Agarumgebung Gewebestudien ergänzt, die darauf abzielen, die mikrobielle metabolische Zusammenarbeit zwischen diesen beiden pathogenen Organismen in Mausmodellen der Infektion zu verstehen. Bildgebende massenspektrometrische Analysen der Aminosäuremetaboliten Arginin und Ornithin werden als repräsentative Daten dargestellt. Diese Methode ist breit anwendbar auf andere Analyten, mikrobielle Krankheitserreger oder Krankheiten und Gewebetypen, bei denen ein räumliches Maß der Zell- oder Gewebebiochemie gewünscht wird.
Introduction
Das menschliche Mikrobiom ist ein hochdynamisches Ökosystem mit molekularen Wechselwirkungen von Bakterien, Viren, Archaeen und anderen mikrobiellen Eukaryoten. Während mikrobielle Beziehungen in den letzten Jahren intensiv untersucht wurden, muss noch viel über mikrobielle Prozesse auf chemischer Ebeneverstanden werden 1,2. Dies ist zum Teil auf die Nichtverfügbarkeit von Werkzeugen zurückzuführen, die in der Lage sind, komplexe mikrobielle Umgebungen genau zu messen. Fortschritte auf dem Gebiet der bildgebenden Massenspektrometrie (IMS) in den letzten zehn Jahren haben die räumliche Kartierung vieler Metaboliten, Lipide und Proteine in biologischen Substraten in situ und markierungsfrei ermöglicht 3,4. Die Matrix-unterstützte Laserdesorption/-ionisation (MALDI) hat sich als die gebräuchlichste Ionisationstechnik in der bildgebenden Massenspektrometrie herausgestellt, bei der ein UV-Laser verwendet wird, um Material von der Oberfläche eines dünnen Gewebeschnitts zur Messung durch Massenspektrometrie4 abzutragen. Dieser Prozess wird durch das Aufbringen einer chemischen Matrix erleichtert, die homogen auf die Oberfläche der Probe aufgebracht wird, so dass sequentielle Messungen in einem Rastermuster über die Probenoberfläche durchgeführt werden können. Nach der Datenerfassung werden dann Heatmaps der Analytionenintensitäten erstellt. Jüngste Fortschritte bei Ionisationsquellen und Probenahmetechniken haben die Analyse von nicht-traditionellen Substraten wie bakteriellen5 und Säugetieren 6,7,8 zellulären Proben ermöglicht, die auf Nährstoffagar gezüchtet wurden. Die molekularen räumlichen Informationen, die von IMS bereitgestellt werden, können einen einzigartigen Einblick in die biochemische Kommunikation von Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen während der Infektion geben 9,10,11,12,13,14.
Bei einer Clostridioides difficile-Infektion (CDI) ist C. difficile einer sich schnell verändernden mikrobiellen Umgebung im Magen-Darm-Trakt ausgesetzt, in der polymikrobielle Interaktionen wahrscheinlich die Infektionsergebnisse beeinflussen15,16. Überraschenderweise ist wenig über die molekularen Mechanismen der Wechselwirkungen zwischen C. difficile und residenten Mikrobiota während der Infektion bekannt. Zum Beispiel sind Enterokokken eine Klasse opportunistischer kommensaler Krankheitserreger im Darmmikrobiom und wurden mit einer erhöhten Anfälligkeit und einem erhöhten Schweregrad von CDI17,18,19,20 in Verbindung gebracht. Über die molekularen Mechanismen der Wechselwirkungen zwischen diesen Erregern ist jedoch wenig bekannt. Um die niedermolekulare Kommunikation zwischen diesen Mitgliedern des Darmmikrobioms zu visualisieren, wurden hier bakterielle Makrokolonien auf Agar gezüchtet, um Mikroben-Mikroben-Interaktionen und bakterielle Biofilmbildung in einer kontrollierten Umgebung zu simulieren. Aufgrund des hohen Wassergehalts und der ungleichmäßigen Oberflächentopographie dieser Proben ist es jedoch schwierig, repräsentative metabolische Verteilungen bei der bildgebenden MALDI-Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkulturproben zu erhalten. Dies wird hauptsächlich durch die stark hydrophile Natur von Agar und die ungleichmäßige Reaktion der Agaroberfläche während der Feuchtigkeitsentfernung verursacht.
Der hohe Wassergehalt von Agar kann es auch schwierig machen, eine homogene MALDI-Matrixbeschichtung zu erreichen, und kann die anschließende MALDI-Analyse im Vakuum21 beeinträchtigen. Zum Beispiel arbeiten viele MALDI-Quellen mit Drücken von 0,1-10 Torr, was ein ausreichendes Vakuum ist, um Feuchtigkeit aus dem Agar zu entfernen, und eine Verformung der Probe verursachen kann. Diese morphologischen Veränderungen im Agar, die durch die Vakuumumgebung induziert werden, verursachen Blasenbildung und Rissbildung im getrockneten Agarmaterial. Diese Artefakte verringern die Haftung des Agars auf dem Objektträger und können dazu führen, dass die Probe in das Vakuumsystem des Instruments zerlegt oder abgeplatzt wird. Die Dicke der Agarproben kann bis zu 5 mm vom Objektträger entfernt sein, was zu einem unzureichenden Abstand von der Ionenoptik im Inneren des Instruments führen kann, was zu einer Kontamination und/oder Beschädigung der Instrumentenionenoptik führen kann. Diese kumulativen Effekte können zu einer Verringerung des Ionensignals führen, das die Oberflächentopographie und nicht die zugrunde liegenden mikrobiellen biochemischen Wechselwirkungen widerspiegelt. Agarproben müssen vor der Analyse im Vakuum homogen getrocknet und fest auf einem Objektträger haften.
Diese Arbeit demonstriert einen Probenvorbereitungs-Workflow für die kontrollierte Trocknung von Bakterienkultur-Makrokolonien, die auf Agarmedien gezüchtet werden. Dieser mehrstufige, langsamere Trocknungsprozess (im Vergleich zu den zuvor berichteten) stellt sicher, dass der Agar gleichmäßig dehydriert und gleichzeitig die Auswirkungen von Blasenbildung oder Rissbildung von Agarproben, die auf Objektträgern montiert sind, minimiert werden. Durch die Verwendung dieser schrittweisen Trocknungsmethode werden die Proben fest auf dem Objektträger haftbar und sind für die anschließende Matrixapplikation und MALDI-Analyse geeignet. Dies wird anhand von Modellbakterienkolonien von C. difficile veranschaulicht, die auf Agar- und Mausgewebemodellen gezüchtet wurden, die CDI mit und ohne das Vorhandensein von kommensalem und opportunistischem Erreger, Enterococcus faecalis, beherbergen. Die bildgebenden Massenspektrometrie-Analysen von Bakterien- und Gewebemodellen von MALDI ermöglichen die räumliche Kartierung von Aminosäure-Metabolitenprofilen und bieten neue Einblicke in den bioenergetischen mikrobiellen Stoffwechsel und die Kommunikation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei der bildgebenden MALDI-Massenspektrometrie ist es wichtig, eine flache Probenoberfläche zu haben, um einen gleichmäßigen Fokusdurchmesser des einfallenden MALDI-Lasers auf dem Probensubstrat zu gewährleisten. Abweichungen in der Probenhöhe können dazu führen, dass sich der MALDI-Laserstrahl unscharf verschiebt, was zu Änderungen des Strahldurchmessers und der Strahlintensität führt, die die MALDI-Ionisationseffizienz beeinträchtigen können. Diese Veränderungen in der Ionisationseffizienz können zu Unter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) unter der Auszeichnung GM138660 unterstützt. J.T.S. wurde durch das Charles and Monica Burkett Family Summer Fellowship der University of Florida unterstützt. J.P.Z. wurde durch die NIH-Zuschüsse K22AI7220 (NIAID) und R35GM138369 (NIGMS) unterstützt. A.B.S. wurde durch den Cell and Molecular Biology Training Grant an der University of Pennsylvania (T32GM07229) unterstützt.
Materials
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
References
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
- Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
- Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
- Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313 (2014).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490 (2019).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nature Reviews Microbiology. 9 (9), 683-694 (2011).
- Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
- Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
- Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
- Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951 (2016).
- Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
- Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
- Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387 (2020).
- Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
- Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869 (2020).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
- Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
- Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
- Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
- Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
- Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
- Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
- Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , (2014).
