감염 중 한천 및 조직에서 자란 박테리아 집락의 이미징 질량 분석 분석을 통한 미생물 협력 조사
Summary
매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 이미징 질량 분석법을 통해 한천 기반 박테리아 거대 콜로니 분석을 위한 새로운 샘플 준비 방법이 시연됩니다.
Abstract
감염 중에 발생하는 미생물 상호 작용의 대사 결과를 이해하는 것은 생물 의학 이미징 분야에 독특한 도전 과제를 제시합니다. MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) 이미징 질량분석법은 다양한 대사 산물에 대한 공간 맵을 생성할 수 있는 라벨이 없는 현장 이미징 방식을 나타냅니다. 얇게 절편된 조직 샘플은 이제 이 기술을 통해 일상적으로 분석되지만, 미생물학 연구에서 한천에서 일반적으로 자라는 박테리아 콜로니와 같은 비전통적인 기질의 이미징 질량 분석 분석은 이러한 샘플의 높은 수분 함량과 고르지 않은 지형으로 인해 여전히 어려운 과제입니다. 이 백서는 이러한 샘플 유형의 이미징 질량 분석 분석을 허용하는 샘플 준비 워크플로우를 보여줍니다. 이 과정은 두 가지 위장 병원체인 Clostridioides difficile 과 Enterococcus faecalis의 박테리아 공동 배양 거대 콜로니를 사용하여 예시됩니다. 이 잘 정의된 한천 환경에서 미생물 상호 작용을 연구하는 것은 또한 감염 마우스 모델에서 이 두 병원성 유기체 간의 미생물 대사 협력을 이해하기 위한 조직 연구를 보완하는 것으로 나타났습니다. 아미노산 대사산물인 아르기닌과 오르니틴의 이미징 질량분석 분석이 대표적인 데이터로 제시됩니다. 이 방법은 다른 분석물, 미생물 병원체 또는 질병, 세포 또는 조직 생화학의 공간적 측정이 필요한 조직 유형에 광범위하게 적용할 수 있습니다.
Introduction
인간 마이크로바이옴은 박테리아, 바이러스, 고세균 및 기타 미생물 진핵생물의 분자 상호 작용을 포함하는 매우 역동적인 생태계입니다. 최근 몇 년 동안 미생물 관계가 집중적으로 연구되었지만 화학적 수준 1,2에서 미생물 과정에 대해 이해해야 할 것이 많이 남아 있습니다. 이는 부분적으로 복잡한 미생물 환경을 정확하게 측정할 수 있는 도구를 사용할 수 없기 때문입니다. 지난 10년 동안 이미징 질량분석법(IMS) 분야의 발전으로 생물학적 기질3,4에서 많은 대사 산물, 지질 및 단백질의 현장 및 표지 없는 공간 매핑이 가능해졌습니다. MALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization)는 질량분석법으로 측정하기 위해 UV 레이저를 사용하여 얇은 조직 절편의 표면에서 물질을 제거하는 것과 관련된 이미징 질량분석법에 사용되는 가장 일반적인 이온화 기법으로 부상했습니다4. 이 공정은 시료 표면에 균일하게 적용된 화학 매트릭스를 적용하여 용이하게 되며, 시료 표면 전체에 걸쳐 래스터 패턴으로 순차적 측정을 수행할 수 있습니다. 그런 다음 분석물 이온 강도의 히트 맵이 데이터 수집 후에 생성됩니다. 이온화 소스 및 샘플링 기술의 최근 발전으로 영양소 한천에서 자란 박테리아5 및 포유류 6,7,8 세포 표본과 같은 비전통적인 기질의 분석이 가능해졌습니다. IMS에 의해 제공되는 분자 공간 정보는 감염동안 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호작용의 생화학적 통신에 대한 독특한 통찰력을 제공할 수 있다 9,10,11,12,13,14.
클로스트리디오이데스 디피실 감염(Clostridioides difficile infection, CDI)이 발생하면, C. 디피실(C. difficile)은 위장관에서 빠르게 변화하는 미생물 환경에 노출되며, 여기서 다미생물 상호작용은 감염 결과에 영향을 미칠 수 있다15,16. 놀랍게도, 감염 동안 C. difficile과 상주 미생물 사이의 상호 작용의 분자 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 예를 들어, 장내구균은 장내 미생물군집에 있는 기회주의적 공생 병원체의 한 종류이며 CDI17,18,19,20에 대한 감수성 및 중증도 증가와 관련이 있습니다. 그러나 이러한 병원체 간의 상호 작용에 대한 분자 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 장내 마이크로바이옴의 이러한 구성원 간의 소분자 통신을 시각화하기 위해, 박테리아 거대 콜로니를 여기에서 한천에서 성장시켜 통제된 환경에서 미생물-미생물 상호 작용 및 박테리아 생물막 형성을 시뮬레이션했습니다. 그러나 박테리아 배양 표본의 MALDI 이미징 질량 분석 분석에서 대표적인 대사 분포를 얻는 것은 이러한 샘플의 높은 수분 함량과 고르지 않은 표면 지형으로 인해 어렵습니다. 이것은 주로 한천의 높은 친수성 특성과 수분 제거 중 불균일한 한천 표면 반응에 기인합니다.
한천의 높은 수분 함량은 또한 균질한 MALDI 매트릭스 코팅을 달성하는 것을 어렵게 만들 수 있으며 진공21에서 수행되는 후속 MALDI 분석을 방해할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 MALDI 소스는 0.1-10 Torr의 압력에서 작동하며, 이는 한천에서 수분을 제거하기에 충분한 진공이며 샘플의 변형을 일으킬 수 있습니다. 진공 환경에 의해 유도된 한천의 이러한 형태학적 변화는 건조된 한천 물질에서 기포 발생 및 균열을 유발합니다. 이러한 아티팩트는 슬라이드에 대한 한천의 부착을 감소시키고 샘플이 기기 진공 시스템으로 분리되거나 박리되는 원인이 될 수 있습니다. 한천 샘플의 두께는 슬라이드에서 최대 5mm까지 떨어져 있을 수 있으며, 이로 인해 기기 내부의 이온 광학 장치에서 불충분한 클리어런스가 생성되어 기기 이온 광학 장치가 오염 및/또는 손상될 수 있습니다. 이러한 누적 효과는 기본 미생물 생화학적 상호 작용보다는 표면 지형을 반사하는 이온 신호의 감소를 초래할 수 있습니다. 한천 샘플은 진공 분석 전에 균일하게 건조되고 현미경 슬라이드에 강하게 부착되어야 합니다.
이 논문은 한천 배지에서 성장한 박테리아 배양 거대 콜로니의 제어된 건조를 위한 샘플 준비 워크플로우를 보여줍니다. 이 다단계의 느린 건조 공정(이전에 보고된 것과 비교)은 현미경 슬라이드에 장착된 한천 샘플의 버블링 또는 균열 영향을 최소화하면서 한천이 균일하게 탈수되도록 합니다. 이 점진적인 건조 방법을 사용하여 샘플을 현미경 슬라이드에 강력하게 부착하고 후속 매트릭스 적용 및 MALDI 분석에 사용할 수 있습니다. 이것은 공생 및 기회 병원체인 Enterococcus faecalis의 존재 여부에 관계없이 CDI를 보유하는 한천 및 쥐 조직 모델에서 성장한 C. difficile의 모델 박테리아 콜로니를 사용하여 예시됩니다. 박테리아 및 조직 모델에 대한 MALDI 이미징 질량 분석 분석을 통해 아미노산 대사 산물 프로파일의 공간 매핑이 가능하여 생체 에너지 미생물 대사 및 통신에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MALDI 이미징 질량 분석 중에는 시료 기판에 입사되는 MALDI 레이저의 일관된 초점 직경을 제공하기 위해 평평한 시료 표면을 갖는 것이 중요합니다. 샘플 높이의 편차로 인해 MALDI 레이저 빔이 초점에서 벗어나 빔 직경과 강도가 변경되어 MALDI 이온화 효율에 영향을 줄 수 있습니다. 이온화 효율의 이러한 변화는 기본 조직 생화학을 반영하지 않고 대신 표면 지형을 반사하는 조직 표면 전반에 걸쳐 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 GM138660 상으로 NIH(National Institutes of Health) NIGMS(National Institute of General Medical Sciences)의 지원을 받았습니다. J.T.S.는 플로리다 대학교의 Charles and Monica Burkett Family Summer Fellowship의 지원을 받았습니다. JPZ는 NIH 보조금 K22AI7220(NIAID) 및 R35GM138369(NIGMS)의 지원을 받았습니다. ABS는 펜실베니아 대학의 세포 및 분자 생물학 교육 보조금(T32GM07229)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
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