Enfeksiyon Sırasında Agar ve Dokuda Yetişen Bakteri Kolonilerinin Görüntüleme Kütle Spektrometrisi Analizi Yoluyla Mikrobiyal İşbirliğinin İncelenmesi
Summary
Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi ile agara bazlı, bakteriyel makrokolonilerin analizi için yeni bir numune hazırlama yöntemi gösterilmiştir.
Abstract
Enfeksiyon sırasında ortaya çıkan mikrobiyal etkileşimlerin metabolik sonuçlarını anlamak, biyomedikal görüntüleme alanına benzersiz bir meydan okuma sunmaktadır. Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) görüntüleme kütle spektrometrisi, çok çeşitli metabolitler için uzamsal haritalar üretebilen, etiketsiz, yerinde bir görüntüleme yöntemini temsil eder. İnce kesitli doku örnekleri artık bu teknoloji ile rutin olarak analiz edilirken, mikrobiyoloji araştırmalarında yaygın olarak agar üzerinde yetiştirilen bakteri kolonileri gibi geleneksel olmayan substratların görüntüleme kütle spektrometresi analizleri, bu örneklerin yüksek su içeriği ve düzensiz topografyası nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu yazıda, bu numune türlerinin kütle spektrometrisi analizlerinin görüntülenmesine olanak tanıyan bir numune hazırlama iş akışı gösterilmektedir. Bu süreç, iki gastrointestinal patojenin bakteriyel ko-kültür makrokolonileri kullanılarak örneklendirilmiştir: Clostridioides difficile ve Enterococcus faecalis. Bu iyi tanımlanmış agar ortamında mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesinin, fare enfeksiyon modellerinde bu iki patojenik organizma arasındaki mikrobiyal metabolik işbirliğini anlamayı amaçlayan doku çalışmalarını tamamladığı da gösterilmiştir. Arjinin ve ornitin amino asit metabolitlerinin görüntüleme kütle spektrometrisi analizleri temsili veri olarak sunulmuştur. Bu yöntem, diğer analitlere, mikrobiyal patojenlere veya hastalıklara ve hücresel veya doku biyokimyasının mekansal bir ölçüsünün istendiği doku tiplerine geniş ölçüde uygulanabilir.
Introduction
İnsan mikrobiyomu, bakterilerin, virüslerin, arkelerin ve diğer mikrobiyal ökaryotların moleküler etkileşimlerini içeren oldukça dinamik bir ekosistemdir. Mikrobiyal ilişkiler son yıllarda yoğun bir şekilde incelenmiş olsa da, kimyasal düzeyde 1,2 mikrobiyal süreçler hakkında anlaşılması gereken çok şey vardır. Bu kısmen, karmaşık mikrobiyal ortamları doğru bir şekilde ölçebilen araçların bulunamamasından kaynaklanmaktadır. Son on yılda görüntüleme kütle spektrometresi (IMS) alanındaki ilerlemeler, biyolojik substratlardaki birçok metabolitin, lipitin ve proteinin in situ ve etiketsiz uzamsal haritalanmasını sağlamıştır 3,4. Matris yardımlı lazer desorpsiyonu / iyonizasyonu (MALDI), kütle spektrometrisi ile ölçüm için ince bir doku kesitinin yüzeyinden malzemeyi ablate etmek için bir UV lazerinin kullanılmasını içeren, kütle spektrometrisinin görüntülenmesinde kullanılan en yaygın iyonizasyon tekniği olarak ortaya çıkmıştır4. Bu işlem, numunenin yüzeyine homojen olarak uygulanan kimyasal bir matrisin uygulanmasıyla kolaylaştırılır ve numune yüzeyi boyunca sıralı ölçümlerin raster deseninde yapılmasına izin verir. Analit iyon yoğunluklarının ısı haritaları daha sonra veri toplamayı takiben oluşturulur. İyonizasyon kaynakları ve örnekleme tekniklerindeki son gelişmeler, besin agar üzerinde yetiştirilen bakteriyel5 ve memeli 6,7,8 hücresel örnekleri gibi geleneksel olmayan substratların analizini sağlamıştır. IMS tarafından sağlanan moleküler mekansal bilgi, enfeksiyon 9,10,11,12,13,14 sırasında mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerinin biyokimyasal iletişimi hakkında benzersiz bir fikir verebilir.
Clostridioides difficile enfeksiyonu (CDI) üzerine, C. difficile gastrointestinal sistemde hızla değişen bir mikrobiyal ortama maruz kalır ve polimikrobiyal etkileşimlerin enfeksiyon sonuçlarını etkilemesi muhtemeldir15,16. Şaşırtıcı bir şekilde, enfeksiyon sırasında C. difficile ve yerleşik mikrobiyota arasındaki etkileşimlerin moleküler mekanizmaları hakkında çok az şey bilinmektedir. Örneğin, enterokoklar, bağırsak-mikrobiyomdaki fırsatçı kommensal patojenlerin bir sınıfıdır ve CDI17,18,19,20’ye duyarlılığının ve şiddetinin artmasıyla ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, bu patojenler arasındaki etkileşimlerin moleküler mekanizmaları hakkında çok az şey bilinmektedir. Bağırsak mikrobiyomunun bu üyeleri arasındaki küçük moleküllü iletişimi görselleştirmek için, kontrollü bir ortamda mikrop-mikrop etkileşimlerini ve bakteriyel biyofilm oluşumunu simüle etmek için burada agar üzerinde bakteriyel makrokoloniler yetiştirildi. Bununla birlikte, bakteri kültürü örneklerinin MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi analizi üzerine temsili metabolik dağılımların elde edilmesi, bu örneklerin yüksek su içeriği ve düzensiz yüzey topografyası nedeniyle zordur. Bu, büyük ölçüde agarın yüksek hidrofilik doğasından ve nem giderme sırasında düzgün olmayan agar yüzey tepkisinden kaynaklanır.
Agarın yüksek su içeriği ayrıca homojen MALDI matris kaplaması elde etmeyi zorlaştırabilir ve vakum21’de gerçekleştirilen sonraki MALDI analizine müdahale edebilir. Örneğin, birçok MALDI kaynağı, agardaki nemi gidermek için yeterli bir vakum olan ve numunenin deformasyonuna neden olabilen 0.1-10 Torr basınçlarında çalışır. Vakum ortamının neden olduğu agardaki bu morfolojik değişiklikler, kurutulmuş agar materyalinde köpürme ve çatlamaya neden olur. Bu artefaktlar, agarın slayta yapışmasını azaltır ve numunenin alet vakum sistemine sökülmesine veya dökülmesine neden olabilir. Agar numunelerinin kalınlığı kızaktan 5 mm’ye kadar çıkabilir, bu da cihazın içindeki iyon optiklerinden yetersiz boşluk oluşturarak kontaminasyona ve/veya cihaz iyon optiklerinde hasara neden olabilir. Bu kümülatif etkiler, altta yatan mikrobiyal biyokimyasal etkileşimlerden ziyade, yüzey topografyasını yansıtan iyon sinyalinin azalmasına neden olabilir. Agar numuneleri homojen olarak kurutulmalı ve vakumda analizden önce mikroskop kaydırağına kuvvetlice yapıştırılmalıdır.
Bu yazıda, agar ortamında yetiştirilen bakteri kültürü makrokolonilerinin kontrollü kurutulması için bir numune hazırlama iş akışı gösterilmektedir. Bu çok adımlı, daha yavaş kurutma işlemi (daha önce bildirilenlere göre), mikroskop slaytlarına monte edilmiş agar numunelerinin köpürmesi veya çatlaması etkilerini en aza indirirken, agarın eşit şekilde dehidrate olmasını sağlar. Bu kademeli kurutma yöntemi kullanılarak, numuneler mikroskop sürgüsüne kuvvetlice yapıştırılır ve sonraki matris uygulaması ve MALDI analizi için uygun hale getirilir. Bu, kommensal ve fırsatçı patojen Enterococcus faecalis’in varlığı olan ve olmayan CDI’yi barındıran agar ve murin doku modellerinde yetiştirilen C. difficile modeli bakteri kolonileri kullanılarak örneklendirilmiştir. Hem bakteri hem de doku modellerinin MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi analizleri, amino asit metabolit profillerinin mekansal haritalandırılmasına izin vererek, biyoenerjetik mikrobiyal metabolizma ve iletişim hakkında yeni bilgiler sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi sırasında, numune substratı üzerindeki olay MALDI lazerinin tutarlı bir odak çapını sağlamak için düz bir numune yüzeyine sahip olmak önemlidir. Numune yüksekliğindeki sapmalar, MALDI lazer ışınının odak dışına kaymasına neden olarak ışın çapı ve yoğunluğunda değişikliklere neden olabilir ve bu da MALDI iyonizasyon verimliliğini etkileyebilir. İyonizasyon verimliliğindeki bu değişiklikler, doku yüzeyi boyunca altta yatan doku biyokimyasın?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, GM138660 ödülü altında Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) tarafından desteklenmiştir. J.T.S., Florida Üniversitesi’nden Charles ve Monica Burkett Ailesi Yaz Bursu tarafından desteklendi. J.P.Z., NIH hibeleri K22AI7220 (NIAID) ve R35GM138369 (NIGMS) tarafından desteklenmiştir. A.B.S., Pennsylvania Üniversitesi’ndeki Hücre ve Moleküler Biyoloji Eğitim Bursu (T32GM07229) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
References
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
- Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
- Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
- Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313 (2014).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490 (2019).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nature Reviews Microbiology. 9 (9), 683-694 (2011).
- Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
- Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
- Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
- Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951 (2016).
- Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
- Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
- Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387 (2020).
- Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
- Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869 (2020).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
- Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
- Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
- Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
- Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
- Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
- Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
- Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , (2014).
