Summary
マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析 による 寒天ベースの細菌マクロコロニーの分析のための新しいサンプル調製方法が実証されています。
Abstract
感染中に発生する微生物相互作用の代謝結果を理解することは、生物医学イメージングの分野に独自の課題を提示します。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)イメージング質量分析は、さまざまな代謝物の空間マップを生成できるラベルフリーの in situ イメージングモダリティです。薄く切片化された組織サンプルは現在、この技術 を介して 日常的に分析されていますが、微生物学研究で寒天上で一般的に成長している細菌コロニーなどの非伝統的な基質のイメージング質量分析分析は、これらのサンプルの高含水率と不均一なトポグラフィーのために依然として困難です。この論文では、これらのサンプルタイプのイメージング質量分析を可能にするサンプル調製ワークフローを示します。このプロセスは、2つの胃腸病原体、 クロストリジオイデス・ディフィシル および エンテロコッカス・フェカリスの細菌共培養マクロコロニーを用いて例示される。この明確に定義された寒天環境での微生物相互作用の研究は、感染のマウスモデルにおけるこれら2つの病原性生物間の微生物代謝協力を理解することを目的とした組織研究を補完することも示されています。アミノ酸代謝物であるアルギニンとオルニチンのイメージング質量分析分析を代表的なデータとして提示します。この方法は、他の分析物、微生物病原体または疾患、および細胞または組織生化学の空間的測定が望まれる組織タイプに広く適用できます。
Introduction
ヒトマイクロバイオームは、細菌、ウイルス、古細菌、およびその他の微生物真核生物の分子相互作用を含む非常に動的な生態系です。近年、微生物の関係が熱心に研究されていますが、化学レベルでの微生物プロセスについては多くのことが理解されていません1,2。これは、複雑な微生物環境を正確に測定できるツールが利用できないことが一因です。過去10年間のイメージング質量分析(IMS)の分野における進歩により、生物学的基質中の多くの代謝物、脂質、およびタンパク質のin situおよびラベルフリーの空間マッピングが可能になりました3,4。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)は、質量分析による測定のために薄い組織切片の表面から材料をアブレーションするためにUVレーザーを使用することを含む、イメージング質量分析で使用される最も一般的なイオン化技術として浮上しています4。このプロセスは、サンプルの表面に均一に塗布された化学マトリックスの適用によって促進され、サンプル表面全体のラスターパターンで連続的な測定を行うことができます。分析種のイオン強度のヒートマップは、データ収集後に生成されます。イオン化源とサンプリング技術の最近の進歩により、栄養寒天上で増殖した細菌5や哺乳類の6,7,8細胞標本などの非伝統的な基質の分析が可能になりました。IMSが提供する分子空間情報は、感染中の微生物-微生物および宿主-微生物相互作用の生化学的コミュニケーションに関する独自の洞察を提供することができます9,10,11,12,13,14。
クロストリジオイデス・ディフィシル感染(CDI)の際、 C.ディフィシル 胃腸管の急速に変化する微生物環境にさらされ、ポリ微生物相互作用が感染結果に影響を与える可能性があります15,16。驚くべきことに、感染中のC.ディフィシルと常在微生物叢との相互作用の分子メカニズムについてはほとんど知られていません。たとえば、腸球菌は腸内細菌叢における日和見共生病原体のクラスであり、CDI17,18,19,20に対する感受性と重症度の増加に関連しています。しかし、これらの病原体間の相互作用の分子メカニズムについてはほとんど知られていません。腸内細菌叢のこれらのメンバー間の低分子コミュニケーションを視覚化するために、細菌マクロコロニーを寒天上で増殖させ、制御された環境での微生物間相互作用および細菌バイオフィルム形成をシミュレートした。しかし、細菌培養標本のMALDIイメージング質量分析分析で代表的な代謝分布を得ることは、これらの試料の含水率が高く、表面トポグラフィーが不均一であるため、困難です。これは主に、寒天の親水性が高く、水分除去時の寒天表面応答が不均一であることに起因しています。
寒天の含水率が高いと、均質なMALDIマトリックスコーティングを達成することが困難になり、真空中で実行されるその後のMALDI分析が妨げられる可能性があります21。例えば、多くのMALDI源は0.1〜10 Torrの圧力で動作し、これは寒天から水分を除去するのに十分な真空であり、サンプルの変形を引き起こす可能性があります。真空環境によって誘発される寒天のこれらの形態変化は、乾燥した寒天材料にバブリングと亀裂を引き起こします。これらのアーチファクトは、寒天のスライドへの付着を減らし、機器の真空システムへのサンプルの降車または剥離を引き起こす可能性があります。寒天サンプルの厚さはスライドから最大5mm離れているため、装置内のイオン光学系からのクリアランスが不十分になり、機器のイオン光学系に汚染や損傷を引き起こす可能性があります。これらの累積的な効果は、根底にある微生物の生化学的相互作用ではなく、表面トポグラフィーを反映するイオンシグナルの減少をもたらす可能性があります。寒天サンプルは、真空中で分析する前に、均一に乾燥し、顕微鏡スライドに強く接着する必要があります。
この論文は、寒天培地上で増殖した細菌培養マクロコロニーの制御された乾燥のためのサンプル調製ワークフローを示しています。この多段階の遅い乾燥プロセス(以前に報告されたものと比較して)は、顕微鏡スライドに取り付けられた寒天サンプルの泡立ちや亀裂の影響を最小限に抑えながら、寒天が均一に脱水することを保証します。この段階的な乾燥方法を使用することにより、サンプルは顕微鏡スライドに強く接着され、その後のマトリックス塗布およびMALDI分析に適しています。これは、寒天およびマウス組織モデル上で増殖した C.ディフィシル のモデル細菌コロニーを用いて例示され、共生および日和見病原体であるエンテロコッカス・フェカリスの存在の有無にかかわらずCDIを保有する。細菌モデルと組織モデルの両方のMALDIイメージング質量分析分析により、アミノ酸代謝物プロファイルの空間マッピングが可能になり、生体エネルギー微生物の代謝とコミュニケーションに関する新しい洞察が得られます。
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Protocol
注:動物実験は、フィラデルフィア小児病院およびペンシルベニア大学ペレルマン医学部の動物管理および使用委員会によって承認されました(プロトコルIAC 18-001316および806279)。
注意: クロストリジウム ディフィシル(C.ディフィシル)および エンテロコッカスフェカリス (E.フェカリス)はBSLII病原体であり、細心の注意を払って取り扱う必要があります。.必要に応じて、適切な除染プロトコルを利用します。
1. 細菌培養マクロコロニーの増殖と翌日出荷の準備
- C. difficileおよびE. faecalisの一晩培養物を調製し、0.5%酵母エキスと0.1%L-システイン(BHIS)を添加した脳心臓注入ブロス中で嫌気性チャンバー(85%窒素、10%水素、5%二酸化炭素)で37°Cで個別に増殖させます。すべてのメッキサンプルに1.5%寒天を使用してください。
- 細菌培養培地を600 nmの光学密度(OD600)に正規化します。各マクロコロニー5 μLをBHIS + l-システイン寒天プレート上にプレートし、37°Cで7日間嫌気的に増殖させます。 混合種のマクロコロニーの場合は、プレーティング前に細菌培養培地を1:1の比率で混合します。
- 酸化インジウムスズ(ITO)でコーティングされた顕微鏡スライドをオーム計を使用して準備し、導電性コーティングでスライドの側面を識別します。先端がダイヤモンドのスクライブを使用して、顕微鏡スライドのITOコーティングされた面をエッチングし、ラベルを付けます。
- 寒天成長プレートから培養物全体を切り取り、寒天とスライドの間に気泡が閉じ込められないことを確認しながら、ITOコーティングされた顕微鏡スライドに取り付けます。
注:寒天培地の水分含有量は、培養物が顕微鏡スライド面に自然に付着することを可能にするはずです。このプロセスを例示するビデオは、Yangらの補足文書22で提供されています。 - 保護のためにコロニーを顕微鏡スライドボックスに入れます。スライドボックスを8インチx 8インチのバイオハザード検体輸送バッグに一握りの乾燥剤ペレットと一緒に保管し、さらなる処理と分析のために一晩輸送するために密封します。
注:周囲条件下で出荷する場合は、細菌の増殖と代謝を遅らせ、分析まで細菌検体の固定を維持するために、細菌培養物の乾燥した環境を維持することが重要です。この輸送方法は、広範な実験を通じて最適化されており、ドライアイスで凍結したコロニーを輸送するよりも好まれています。乾燥前の大きな温度変化は、マウントされた寒天サンプルの下で降車して泡立つ傾向があります。
2. C. difficile + E. faecalis 細菌マクロコロニーの常温乾燥
- ITOコーティングされた顕微鏡スライドに取り付けられたアガロース細菌コロニーを包装材料から取り出します。サンプルを乾燥剤の入ったドライボックスに室温で48〜72時間入れます。
注:これは、顕微鏡のスライド面からの寒天培地の泡立ち、ひび割れ、または剥離を最小限に抑える、穏やかでゆっくりとした乾燥プロセスです。 - 汚染されたすべての梱包材を適切に廃棄し、適切な殺菌/殺胞子消毒剤でワークスペースを除染します。
- 寒天表面の変形(バブリング、ひび割れ、取り外しなど)がないかコロニーを目視検査します。
注意: アガロース表面の高さは目に見えて減少し、スライド全体で平らになる必要があります。
3. C. difficile + E. faecalis 細菌マクロコロニーの真空および熱媒介乾燥
注:寒天サンプルから余分な水分を除去しやすくするために、カスタムビルドの真空乾燥装置(図1)が構築されました。この装置は、HEPAバイオフィルター、コールドトラップ、および細菌サンプルが配置されるステンレス鋼チャンバーにインラインで接続されたロータリーベーン真空ポンプを利用しています。可変電圧変圧器は絶縁電線フィラメントに接続されており、これによりユーザーはチャンバーを加熱して乾燥プロセスを促進することができます。
- サンプルチャンバーへの真空ラインを閉じ、 ロータリーベーン ポンプの電源スイッチをオンにして、真空ポンプを暖め、適切な真空圧を達成できるようにします。
- 可変電圧変圧器をオンにして、チャンバーに巻き付けられたワイヤーフィラメントを加熱します。真空チャンバーの内部温度が~50°Cに達するまで可変電源を調整します。ポンプがウォームアップしている間に、ドライアイスと100%エタノールのスラリーをコールドトラップのコンデンサーに入れます。
注意: コールドトラップは、サンプルからの蒸気や胞子を凝縮し、ロータリーベーンポンプシステムと真空ポンプオイルの汚染を防ぎます。 - レンチを使用して真空チャンバーを開き、16mmのダブルクローフランジクランプを緩めます。アガロースサンプルをチャンバーに挿入し、16 mmのダブルクローフランジクランプでチャンバーをしっかりと密閉します。
- ポンプバルブを開いてチャンバーを排気します。サンプルを60〜120分間乾燥させます(例:~150 mTorr)。
注:この乾燥時間は、小さな寒天セクションの水分の大部分を除去するのに十分です。水分除去と寒天高さの減少に最適な乾燥時間を経験的に決定することは、個々のセットアップとサンプルに応じて必要になる場合があります。乾燥時間が大幅に長いと、乾燥寒天がもろくなり、ひび割れやすくなります。 - 完了したら、ロータリーベーンポンプのバルブを閉じ、外部バルブを周囲空気に開放して、真空チャンバーをゆっくりと周囲圧力までベントします。前述のプロトコルを使用してチャンバーを開き、乾燥したアガロースサンプルをチャンバーから取り出します。
- マトリックス塗布まで乾燥剤の入ったドライボックスにサンプルを保管します。
注: 図2 は、乾燥前と乾燥後の寒天表面の画像を示しています。
4. ロボットスプレーによる MALDIマトリックス塗布
注:アガロースサンプルが完全に乾燥され、培養セクションの高さが著しく減少した後、ロボットマトリックス噴霧器を使用して、化学MALDIマトリックス化合物の薄いコーティングを均一に塗布します。この手順は、化学ヒュームフードで、手袋、実験用眼鏡、白衣などの適切な個人用保護具を使用して実行する必要があります。
- 適切な MALDI マトリックスを選択します。このプロトコルに従うには、マイナスイオンモードでアミノ酸の良好な脱離とイオン化のために1,5-ジアミノナフタレン(DAN)MALDIマトリックスを使用します。
- 10 mL の 10 mg/mL DAN MALDI マトリックス溶液を 90/10 (v/v) アセトニトリル/水で調製します。HPLCグレードの溶媒を使用し、30分間超音波処理し、ロボット噴霧器シリンジポンプに導入する前に、0.2μmナイロンシリンジフィルターで溶液をろ過します。さらに、各使用の間に噴霧器ラインがきれいになるように洗浄液を調製してください。
注意: 洗浄液は、噴霧器ライン内のマトリックスおよびその他の汚染物質の溶解度を高め、システムからの除去を容易にするために選択されます。ここで使用される洗浄溶液は、90/10(v / v)アセトニトリル/水、50/50(v / v)水/メタノール、99/1(v / v)アセトニトリル/酢酸、および95/5(v / v)水/水酸化アンモニウムです。 - サンプルを噴霧器トレイに取り付け、調製した溶液を噴霧器ラインにロードします(図3)。コンピュータソフトウェアを使用して、マトリックス化合物の均一なコーティングを可能にするために必要なパラメータを指定します: 30°Cノズル温度、8パス、0.1mL/min流量、CCパターン、0秒乾燥時間、10psi。
注:ほとんどの病原体は、通常は小さな有機酸または塩基であるMALDIマトリックスの適用によって不活性化されることが一般に認められています。 - 噴霧シーケンスが終了したら、サンプルを噴霧器トレイから取り出し、分析するまで乾燥キャビネットに保管します。
5. MALDIイメージング質量分析データ取得のための細菌マクロコロニーの調製(英語)
注:すべてのイメージング質量分析は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FTICR)質量分析計を使用して実行されました。この機器には、Nd:YAG MALDIレーザーシステム(2 kHz、355 nm)が装備されています。
- マトリックスコーティングされたサンプルをMALDIターゲットプレート顕微鏡スライドアダプターに挿入し、永久マーカーを使用してサンプル領域を囲む少なくとも3つの基準マーカーをスクライブします(図4)。フラットベッドスキャナーを使用して、基準マーカーを含む顕微鏡スライドの光学画像を取得します。
注意: 基準マーカーを使用すると、光学画像をMALDIカメラに登録できます view 機器で観察されます。 - 質量校正、MALDIレーザー設定、イオン光学パラメータ、ICRセル条件など、目的の質量範囲、感度、分解能に最適化されたMS装置メソッドを定義します。この方法では、目的の代謝物のm/z値を含む選択イオン連続蓄積(CASI)アプローチ23を使用して、マイナスイオンモードでの気相シグナル濃縮のために、m/z 100から200までの100Da質量ウィンドウを選択します。
- 機器の画像集録ソフトウェアを開き、 セットアップウィザード を使用して、 ファイル名 と 場所、 MS集録方法、サンプリングする 関心領域 、画像の 空間分解能 を定義します。
注:細菌マクロコロニーイメージングには通常、100〜300μmの空間分解能が使用されます。 - すべてのパラメータを定義したら、アクイジションシーケンスを開始して、定義された対象領域全体の各ピクセルでマススペクトルをシリアルにアクイジションします。
注意: 画像取得時間は機器の設定によって異なりますが、通常、2〜6ピクセルを含む画像の場合は5,000〜10,000時間の範囲です。
6. イメージング質量分析データ解析と化合物同定
- 画像取得後、イメージング質量分析プラットフォーム用のベンダー固有のファイル形式である「.mis」ファイル拡張子でデータを保存します。flexImagingまたはSCiLSソフトウェアパッケージでデータファイルを開くか、.mzmlなどの非独占的なデータ形式にエクスポートし、ベンダーに依存しないソフトウェア(Cardinal24やMSIreader25,26など)を使用して視覚化します。
注:FlexImagingでイメージングデータを開くと、サンプリングされた領域で検出されたすべてのイオンの平均強度を表す平均マススペクトルが表示されます。関心のあるピークは、正確な質量測定に基づいて暫定的に特定できます。通常、FTICR質量分析計での代謝物同定には、5ppmを超える質量精度で十分です。 - 参照されているソフトウェアを使用して、関心のあるピークのマスウィンドウを定義し、サンプリングされた領域全体のイオン分布の偽カラーヒートマップを生成します。
- 平均マス スペクトル 表示で、目的のピークにズームインし、ピークプロファイルの領域を含む適切なマスウィンドウを選択します。
- 強調表示されたマスウィンドウを右クリックし、[ マスフィルタを追加]を選択します。高分解能の正確な質量測定によって決定された疑わしい代謝物の暫定的な識別を使用して、選択した m/z 値にラベルを付けます。
- 強度しきい値を選択して、疑似カラーヒートマップによって表示される分析種画像のダイナミックレンジを調整します。マス フィルター パラメーターをさらに調整して、マス ウィンドウがピーク プロファイルの領域を含むようにしてから、マス フィルターを追加します。
注:強度の正規化を適切に実行して、測定領域全体の相対的な定量化を向上させることができます。ここでの実験では、CASIデータ収集(後図)を利用しているため、総イオン数(TIC)および二乗平均平方根(RMS)正規化方法が不正確になる可能性があります。そのため、本明細書に示す全てのイオン像は、正規化なしで表示される。
7.非感染コントロールおよび C.ディフィシル 感染マウス盲腸組織の調製と出荷
- 4〜8週齢のC57BL / 6雄マウスに抗生物質(0.5 mg / mLセフォペラゾンまたは0.5 mg / mLセフォペラゾン+ 1 mg / mLバンコマイシン)を飲料水に 5日間自由摂取 させ、その後2日間の回復期間とその後感染させます。
- CO2催眠により動物を安楽死させ、マウス盲腸器官を直ちに採取する。蒸留水中の最適切削温度(OCT)コンパウンドの20%混合物に埋め込みます。
- サンプルをドライアイスの上に置き、分析のためにパッケージ化して出荷します。分析するまで-80°Cで保存してください。
8.非感染対照の凍結切片 verus C. difficile 感染マウス盲腸組織
- 100%エタノールですすいですべての凍結切片装置を洗浄し、サンプルをクライオスタットチャンバーに入れる前に乾燥させます。抵抗計を使用してITOコーティングされた顕微鏡スライドを準備し、導電性コーティングでスライドの側面を識別します。先端がダイヤモンドのスクライブを使用して、顕微鏡スライドのITOコーティングされた面をエッチングし、ラベルを付けます。
注意: 手袋、実験用メガネ、白衣、クライオスタットスリーブなどの適切な個人用保護具を着用する必要があります。 - 研究用クライオミクロトームで凍結切片を実行します。OCT包埋マウス盲腸組織を-80°Cの冷凍庫からドライアイス上のクライオミクロトームチャンバー(チャンバー温度30°C、物体温度-28°C)に移します。イメージング質量分析を使用して比較する組織サンプル(例:非感染コントロールと C.ディフィシル感染)を同じ顕微鏡スライドにマウントして、両方の組織タイプの同一のサンプル調製を確保し、正確な代謝物比較を可能にします。
- クライオミクロトームチャンバー内で、追加のOCT溶液を使用して、OCT埋め込み組織をサンプルチャックに取り付けます。OCT溶液が固まったら、チャックを試料ヘッドに固定します。10〜50μm刻みで凍結切片を開始して、臓器の目的の組織の深さ/平面に到達します。
- 組織の最適な断面に到達したら、12 μmの厚さで切片の収集を開始します。アーティストのペイントブラシを使用してスライスをそっと操作し、テフロンコーティングされた顕微鏡スライドに置きます。
- ITOコーティングされた顕微鏡スライドを組織セクションの上に転がして、テフロンコーティングされたスライドから組織をピックアップします。ITOコーティングされたスライドの背面に手のひらを押して、組織セクションを顕微鏡スライドに解凍マウントします。組織切片が半透明から不透明/マットなテクスチャに移行するまで、解凍マウントを続けます。
- ドライアイス上の組織装着型顕微鏡スライドを乾燥剤の入ったドライボックスに移して同日分析用に保管するか、-80°Cで保存して長期保存します。
9.マトリックスアプリケーションおよびMALDIイメージング質量分析のための非感染コントロールと C.ディフィシル 感染マウス盲腸組織の調製
- ステップ4で説明されているのと同じプロトコルを使用してMALDIマトリックスアプリケーションを実行します(30°Cノズル温度、8パス、0.1 mL /分の流量、CCパターン、0秒の乾燥時間、10 psi)。
- 手順5および6で説明したのと同じプロトコルを使用してMALDIイメージング質量分析を実行します。
- 複数の生物学的反復からのイオン画像を分析し、上記のSCiLS統計ソフトウェアを使用した強度ボックスプロット比較 を介して 有意性の結果を比較する。
注:適切な統計的検定と比較はアプリケーションによって異なり、識別および相関スペクトル特徴を決定するための空間セグメンテーション、分類モデル、および比較分析を含めることができます。比較分析には、有意な特徴への p値の割り当て、組織比較のための主成分分析の生成、変動を特定するための箱ひげ図の視覚化などがあります。イメージング質量分析後にヘマトキシリンおよびエオジン(H&E) を介して 染色された組織切片の明視野顕微鏡を使用して組織を視覚化することも有用である。これにより、組織内の形態学的特徴を明確に識別することができ、訓練を受けた病理学者と相談して分析することができます。
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Representative Results
我々は、微生物間相互作用におけるアミノ酸の役割を研究するために、 E.faecalis および C.ディフィシル と共コロニー化したモデル細菌コロニーおよびマウスの代謝物MALDIイメージング質量分析を実施しました。寒天上で増殖した細菌マクロコロニーは、細菌バイオフィルム形成における明確な生化学的変化を分析するための明確に定義されたモデルとして機能します。寒天培地上で増殖した細菌培養マクロコロニーの制御された乾燥プロセスを確保して、寒天表面の変形や亀裂を最小限に抑えることが重要です。これは、周囲温度および圧力下での乾燥剤による予備乾燥と、それに続く高温で実行されるより迅速な真空支援乾燥ステップを含む2段階のプロセス によって 達成された。特注の乾燥装置を使用して、寒天脱水を促進しながら、サンプルからの細菌汚染物質または胞子の放出を捕捉しました(図1)。追加の真空乾燥ステップは、サンプルが完全に脱水され、MS真空にさらされても変形しないようにするために必要です。
寒天切片は、最初はサンプルの高さが2〜4 mmでしたが(図2A)、乾燥プロトコルに従って高さが~0.5 mmに減少しました(図2B)。このサンプル調製プロトコルでは、サンプル表面全体で均一な乾燥を確保することが重要です。サンプルの高さに大きなばらつきがあると、サンプル表面でMALDIレーザービームの焦点が合ってしまい、イオン化効率と分析種のイオン強度に悪影響を与える可能性があります。乾燥プロセスの失敗の例を 図2Dに示しますが、寒天表面が気泡やひび割れが発生し、サンプルがさらなる分析に使用できなくなっています。細菌サンプルが完全に乾燥したら、ロボット噴霧器を使用してDAN MALDIマトリックス層を塗布します(図3)。この装置は、スプレーパラメータの正確な制御を可能にし、均一なマトリックスコーティングの適用を可能にします(図2C)。
マトリックス塗布に続いて、サンプルを含む顕微鏡スライドをスライドアダプターに挿入して、FTICR MSで分析します(図4)。スライド上の座標は、最初に測定される領域の周りのスライド上に基準マークを描くことによって、イメージング質量分析取得ソフトウェアと計器カメラの間で登録される( 図4の「+」記号で示される)。次に、フラットベッドスキャナーを使用してスライドをデジタルスキャンして光学画像を記録し、flexImagingソフトウェアで取得シーケンスを定義するために使用されます。代謝物アニオンの透過と検出のための質量分析装置の設定を最適化しました。CASI気相イオン濃縮を使用して、組織表面から観察された化合物の配列を含む m/z 150 ± 50 Daでイオンを選択的に蓄積するようにイオン分離ウィンドウを定義しました(図5A)。特にここでは C.ディフィシル 感染、我々は、細菌異化作用の間に興味深く変化する役割を示すアミノ酸経路を発見しました。正確な質量測定に基づいて、イオンシグナルはm / z 131.083および m / z 173.104でオルニチンであることが特定されました(0.34 ppm質量誤差; 図5B)アルギニン(0.43ppmの質量誤差; 図5C)をそれぞれ示す。
細菌マクロコロニーのイメージング質量分析は、C.ディフィシル単培養およびC.ディフィシル+E.フェカリス共培養コロニーで実施しました(図6)。MALDIマトリックス塗布後のサンプルの光学画像は、コロニーバイオフィルムの外側領域に及ぶ関心のある取得領域を強調しています(図6A、C)。これらのサンプルのイメージング質量分析により、オルニチンとアルギニンの両方のアミノ酸代謝物の空間マッピングが可能になり、E.faecalisの存在下で変化し、局在が異なることがわかっています(図6B、D)。例えば、アルギニンは、C.ディフィシル+E.フェカリス共培養と比較して、C.ディフィシル単培養において有意に豊富である(図6D)。また、C. difficile s胞子、C. difficile s胞子 + E. faecalis 細胞 (wt) (5 ×10 8/mL)、または C. difficile s胞子 + E. faecalis (ArcD 変異体) 細胞 (5 × 108/mL) のいずれかに感染した 8 週齢の無菌 C57BL/6 雌マウスを用いた感染モデルへのイメージング質量分析を拡大しました(図 7)27。.マウス盲腸を採取し、臓器の形状と忠実度を維持するために25%OCT化合物で凍結しました。OCTコンパウンドは、凍結切片中に薄い組織切片をサポートするのにも役立ちました。上記のプロトコルと同様に、組織切片をDAN MALDIマトリックス層でコーティングし、フラットベッド光学スキャナーを使用してスキャンし(図7B)、MALDIイメージング質量分析によって分析します(図7C)。イメージング質量分析分析後の組織切片に対して組織学的染色を行い、高分解能明視野光学スキャンを使用して組織形態を評価しました(図7A)。上皮細胞層は、対照組織と比較して、感染中に明らかに炎症を起こしている。
図1:自作の真空乾燥装置。 特注の真空乾燥装置を使用して、寒天サンプルからの水分除去を促進します。サンプルは真空チャンバーに入れられ、真空チャンバーはロータリーベーンポンプを使用して密閉および排気され、可変電圧変圧器を使用して加熱されます。サンプルからの汚染物質の蒸気/胞子は、コールドトラップとHEPAインラインフィルターにトラップされます。通常、100〜150mTorrの圧力が使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:細菌マクロコロニーの乾燥と調製。乾燥および真空アシスト乾燥を用いた水分除去前および(B)後の寒天試料(A)の光学像。(C)1,5-ジアミノナフタレンMALDIマトリックスを、ロボット噴霧器を用いて乾燥後に細菌共培養に塗布する。(D)乾燥に失敗すると、通常、寒天内でひび割れや泡立ちが発生し、さらなる分析に使用できなくなります。略語:DAN = 1,5-ジアミノナフタレン;MALDI = マトリックス支援レーザー脱離/イオン化。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アガロースサンプルへのMALDIマトリックスのロボットスプレー。 (A)HTX M5 TM噴霧器と(B)MALDIマトリックスアプリケーション用のロボットマトリックス噴霧器にロードされたアガロースサンプルの画像。略称:MALDI = マトリックス支援レーザー脱離/イオン化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:分析用にサンプルをロードした質量分析計アダプター。 マトリックスコーティングされたアガロースサンプルは、MALDI分析のためにMTPスライドアダプターにロードされます。基準マーカーは黒いプラス記号 ("+") として表示されます。略称:MALDI = マトリックス支援レーザー脱離/イオン化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:同定された代謝物イオンピークの代表的なマススペクトル 。 (A)細菌培養サンプルのマイナスイオンモードMALDI分析により、数十の代謝物を検出できます。高分解能の正確な質量測定により、(B)オルニチンは m/z 131.083(質量誤差0.34ppm)で、(C)アルギニンは m/z 173.104(質量誤差0.43ppm)で暫定的に同定できます。マススペクトルは、 m/z 150で75,000の質量分解能(FWHM)を使用して取得されます。略語:MALDI =マトリックス支援レーザー脱離/イオン化;FWHM = 半値で全幅。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:細菌マクロコロニーのイメージング質量分析分析。 (A,C)アガロース試料の光学画像は、イメージング質量分析のための測定領域を示しており、白破線で強調表示されています。(B,D)オルニチン (m/z 131.083, 0.038 ppm) およびアルギニン (m/z 173.104, 0.60 ppm) の MALDI イオン画像は、細菌培養物全体で固有の空間分布を示しています。なお、絶対強度スケールは、パネルBおよびDに示す共培養イオン像で異なる。例えば、アルギニンは、パネルCおよびDの共培養と比較してC.ディフィシル単培養において有意に多く存在し、この強度スケールは単培養におけるアルギニンの存在量と比較しており、この共培養にはアルギニンは存在しないようである。逆に、AとBの共培養は、アルギニンの強度を画像内の唯一のサンプルであるため、より低い絶対強度スケールに投影します。略語:MALDI =マトリックス支援レーザー脱離/イオン化;CASI =選択されたイオンの連続的な蓄積。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:感染したマウス盲腸組織のイメージング質量分析 。 (A)感染マウスCECAのヘマトキシリンおよびエオジン染色組織の明視野顕微鏡画像により、組織形態の視覚化が可能になります。(B)マウス盲腸組織の光学画像は、DAN MALDIマトリックス層の適用後のサンプルを示しています。(C)オルニチン(m/z 131.083, 0.88 ppm)およびアルギニン(m/z 173.104, 0.15 ppm)のMALDIイオン画像は、組織サンプル全体に固有の空間分布を示しています。略語:MALDI =マトリックス支援レーザー脱離/イオン化;DAN = 1,5-ジアミノナフタレン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
MALDIイメージング質量分析では、サンプル基板に入射するMALDIレーザーの焦点径を一定にするために、サンプル表面を平坦にすることが重要です。サンプルの高さがずれると、MALDIレーザービームの焦点がずれ、ビームの直径と強度が変化し、MALDIイオン化効率に影響を与える可能性があります。イオン化効率のこれらの変化は、下にある組織生化学を反映するのではなく、表面トポグラフィーを反映する組織表面全体の分析物強度の違いをもたらす可能性があります。さらに、ほとんどのMALDIイオン化源は大気圧以下で動作し、水和寒天サンプルは 真空 条件下で受けると壊れやすいサンプルになります。これらのソースの真空は、アガロースサンプルの脱水を引き起こす可能性があり、乾燥中にサンプル表面を変化させる可能性があります。エアポケットや大量の水を含むサンプルは、これらの変化の影響を非常に受けやすいです。この問題は、寒天上で増殖した細菌標本のMALDIイメージング質量分析中によく発生します。栄養寒天は、細菌の増殖を促進するために水分含有量が高いです。ただし、MALDIマトリックスコーティングを適用し、サンプルを質量分析計の真空に導入する前に、できるだけ多くの水分を除去することが不可欠です。
したがって、水和寒天サンプルは 真空 分析には役立ちません。 真空 状態での形態変化に加えて、顕微鏡スライドに取り付けられたサンプルを保持し、MALDIレーザー焦点の適切な位置に持ってくるために使用されるMALDIターゲットプレートスライドアダプターからあまりにも遠くに突き出たサンプル高さにも潜在的な問題があります。MALDIステージ機構は、ステージの他の機械部品と緊密に推測されており、所定の位置にある間、サンプルターゲットプレートの表面とイオン源光学系のフロントエンドの間にわずか数ミリメートルのクリアランスがあります。これにより、サンプルが削り取られ、分析するサンプルが移動したり、完全に降ろされたりする可能性があります。さらに、水和寒天試料は顕微鏡のスライド面に自然に付着しますが、これは完全に乾燥した寒天標本の付着よりもはるかに弱い傾向があります。したがって、水和寒天サンプルはサンプルターゲットプレートの表面からさらに突き出て、接着性が弱くなり、サンプルが下流の機器のイオン光学系に降車して剥離するリスクが高くなります。
MALDIマトリックスの同一性と適用方法の選択も、イメージング質量分析実験で考慮すべき重要な変数です。有機MALDIマトリックスの選択は、サンプル基質と目的のターゲット化合物に大きく依存します。例えば、多くの低分子量代謝産物(MW < 300Da)は、多くの有機酸、リン酸塩、および他の部分から構成されており、これらは負の極性でより容易にイオン化される28。ネガティブモード分析では、それらの化学構造がプロトン(例えば、9-アミノアクリジン、1,5-ジアミノナフタレン)を受け入れるのにより適しており、したがって、関心のある多くの小代謝物イオンに負電荷を残すような塩基性マトリックスが好ましい。目的の分析対象物についてマトリックススクリーニングを実施し、1,5-ジアミノナフタレン(DAN)マトリックスが対照組織サンプルの目的のアミノ酸代謝物に対して最も高いシグナルを生成することを発見しました。MALDIマトリックスの適用中に、目的の分析種がサンプル基板から抽出され、MALDIマトリックスと共結晶化します。場合によっては、「より湿った」マトリックス適用条件により、抽出と共結晶化が増加し、MALDI分析時の分析物検出が改善されます。ただし、マトリックス塗布プロセスで使用される溶媒が多すぎると、分析対象物が組織内で非局在化する可能性があります。マトリックス塗布の条件を選択する際には、効果的な分析種の抽出と組織内の分析種の空間的忠実度の維持のバランスを取ることが重要です。たとえば、カスタムビルドの昇華装置を使用して、均質なマトリックス層をサンプル表面に塗布し、非常に小さなマトリックス結晶サイズ29,30を生成できます。しかしながら、このプロセスは非常に乾燥しており、分析物抽出には最適ではない可能性がある31。ここで使用されるロボット噴霧器は、噴霧圧力、流量、ノズル温度、および分析物抽出およびマトリックス共結晶化の最適化された方法を可能にすることができる他のパラメータの再現性のある正確な制御を提供する32。
ここで使用されるFTICR MSの機器パラメータは、マイナスイオンモードでの代謝物イオンの透過と検出用に最適化されています。これには、低分子量(<m/z 200)のイオンを優先的に透過するように、イオン移動領域のRFおよびDC素子を調整することが含まれます。イオン透過に大きな影響を与えるパラメータには、漏斗RF振幅(65 V)、四重極質量フィルターイオン分離のQ1質量設定(m/z 150)、および六極蓄積セルとICRセル間の飛行時間遅延(0.400 ms)が含まれます。これらの選択されたパラメータ値は、より大きなm/z値のイオンの透過効率を犠牲にして、低いm/z値のイオンをより効率的に透過させる。さらに、選択されたイオンの連続蓄積(CASI)アプローチを利用して、関心のある定義された質量ウィンドウでイオンを選択的に濃縮することができます。このアプローチでは、四重極質量フィルターを使用して、イオン化源から機器の六極子蓄積セルに小さな範囲のm/z値を選択的に送信しますが、この質量ウィンドウの外側にあるm/z値を持つイオンは不安定なイオン軌道を持ち、四重極質量フィルターを通過しません。これにより、対象物質の含有量が少ない分析種を選択的に濃縮し、化学ノイズを排除することで検出限界とダイナミックレンジを最大3桁向上させることができます。FTICR装置プラットフォームの高い質量分解能と質量精度により、同重体(すなわち、同じ公称質量)化合物の容易な分離と代謝物の暫定的な同定が可能になります。
サンプル調製、MALDIマトリックスアプリケーション、およびイメージング質量分析の慎重で再現性のある制御により、コロニーおよび組織サンプル中の細菌生化学の再現性のあるビューが可能になります。細菌マクロコロニーは、微生物感染中の病原体の代謝相互伝達を特徴付けるための単純化されたモデルとして機能し、動物組織などのより複雑なシステムと比較することができます。例えば、アルギニンは、C. difficile+E. faecalis共培養サンプルでは、C. difficile培養単独と比較してわずかに豊富であることがわかり(図6)、これは、エネルギー源としてアルギニンを消費し、ArcDアンチポーター33を介して細胞からオルニチンを輸出するE. faecalisの注目された能力によって裏付けられています。 マクロコロニーの結果は、動物モデルにおけるアミノ酸のこの調節の調査につながりました。C.ディフィシル+E.フェカリス(wt)に感染したマウスは、C.ディフィシル単独で感染したマウスよりも有意に少ないアルギニンを示し(図7C)、コロニー画像結果を要約した。
アルギニン代謝の仮説とArcDアンチポーターの関与を検証するために、E.フェカリスのArcDアンチポーターを介した代謝産物輸送をノックアウトするトランスポゾン変異体を使用しました。C. difficile + E. faecalis(arcD::Tn)に感染したマウスは、野生型共感染モデルと比較してアルギニンの検出の増加とオルニチンの検出の減少を示し(図7C)、一般にC.ディフィシル感染のモデルのみで観察された元のアミノ酸レベルをレスキューします(図7A)。代謝物調節のこの逆の関係は、E. faecalisがC.ディフィシルから産生されるアミノ酸栄養素を交雑摂食するという発見を裏付けています。さらに、組織学的解析では、C. difficileとE. faecalisの両方に感染したマウスによる広範な細胞損傷が示され、これは主にArcDトランスポゾン変異体とは対照的なE.faecalisの野生株で観察されます。これらの結果は、アルギニンとオルニチンがC.ディフィシルの病原性、行動、および
フィットネス27.全体として、このワークフローは、MALDIイメージング質量分析用の寒天ベースの細菌マクロコロニーを調製するための効果的な方法を示し、これらのシステムが感染中の微生物の協力を調べるための有用なモデルとして役立つことを示しています。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
References
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