Summary
Se demuestra un nuevo método de preparación de muestras para el análisis de macrocolonias bacterianas basadas en agar mediante espectrometría de masas de imágenes de ionización / desorción láser asistida por matriz.
Abstract
Comprender las consecuencias metabólicas de las interacciones microbianas que ocurren durante la infección presenta un desafío único para el campo de las imágenes biomédicas. La espectrometría de masas de imágenes de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) representa una modalidad de imagen in situ sin etiquetas capaz de generar mapas espaciales para una amplia variedad de metabolitos. Si bien las muestras de tejido con secciones finas ahora se analizan rutinariamente a través de esta tecnología, los análisis de espectrometría de masas de imágenes de sustratos no tradicionales, como las colonias bacterianas comúnmente cultivadas en agar en la investigación microbiológica, siguen siendo un desafío debido al alto contenido de agua y la topografía desigual de estas muestras. Este documento demuestra un flujo de trabajo de preparación de muestras para permitir el análisis de espectrometría de masas de imágenes de estos tipos de muestras. Este proceso se ejemplifica utilizando macrocolonias de cocultivo bacteriano de dos patógenos gastrointestinales: Clostridioides difficile y Enterococcus faecalis. También se ha demostrado que el estudio de las interacciones microbianas en este entorno de agar bien definido complementa los estudios de tejidos destinados a comprender la cooperación metabólica microbiana entre estos dos organismos patógenos en modelos de infección de ratón. Los análisis de espectrometría de masas de imágenes de los metabolitos de aminoácidos arginina y ornitina se presentan como datos representativos. Este método es ampliamente aplicable a otros analitos, patógenos o enfermedades microbianas y tipos de tejidos donde se desea una medida espacial de la bioquímica celular o tisular.
Introduction
El microbioma humano es un ecosistema altamente dinámico que involucra interacciones moleculares de bacterias, virus, arqueas y otros eucariotas microbianos. Si bien las relaciones microbianas han sido intensamente estudiadas en los últimos años, queda mucho por entender sobre los procesos microbianos a nivel químico 1,2. Esto se debe en parte a la falta de disponibilidad de herramientas capaces de medir con precisión entornos microbianos complejos. Los avances en el campo de la espectrometría de masas (IMS) de imágenes en la última década han permitido el mapeo espacial in situ y libre de etiquetas de muchos metabolitos, lípidos y proteínas en sustratos biológicos 3,4. La desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) se ha convertido en la técnica de ionización más común utilizada en la espectrometría de masas de imágenes, que implica el uso de un láser UV para extirpar material de la superficie de una sección de tejido delgado para su medición por espectrometría de masas4. Este proceso se ve facilitado por la aplicación de una matriz química aplicada homogéneamente a la superficie de la muestra, lo que permite realizar mediciones secuenciales en un patrón ráster a través de la superficie de la muestra. Los mapas de calor de las intensidades de iones de analito se generan después de la adquisición de datos. Los avances recientes en las fuentes de ionización y las técnicas de muestreo han permitido el análisis de sustratos no tradicionales como las bacterias5 y los especímenes celulares 6,7,8 de mamíferos cultivados en agar nutriente. La información espacial molecular proporcionada por IMS puede proporcionar una visión única de la comunicación bioquímica de las interacciones microbio-microbio y huésped-microbio durante la infección 9,10,11,12,13,14.
Tras la infección por Clostridioides difficile (CDI), C. difficile está expuesta a un ambiente microbiano que cambia rápidamente en el tracto gastrointestinal, donde es probable que las interacciones polimicrobianas afecten los resultados de la infección15,16. Sorprendentemente, se sabe poco sobre los mecanismos moleculares de las interacciones entre C. difficile y la microbiota residente durante la infección. Por ejemplo, los enterococos son una clase de patógenos comensales oportunistas en el microbioma intestinal y se han asociado con una mayor susceptibilidad y gravedad de la ICD17,18,19,20. Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos moleculares de las interacciones entre estos patógenos. Para visualizar la comunicación de moléculas pequeñas entre estos miembros del microbioma intestinal, se cultivaron macrocolonias bacterianas en agar para simular las interacciones microbio-microbio y la formación de biopelículas bacterianas en un ambiente controlado. Sin embargo, la obtención de distribuciones metabólicas representativas en el análisis de espectrometría de masas de imágenes MALDI de muestras de cultivo bacteriano es un desafío debido al alto contenido de agua y la topografía superficial desigual de estas muestras. Esto se debe en gran parte a la naturaleza altamente hidrófila del agar y la respuesta superficial no uniforme del agar durante la eliminación de humedad.
El alto contenido de agua del agar también puede dificultar la obtención de un recubrimiento homogéneo de la matriz MALDI y puede interferir con el análisis MALDI posterior realizado en el vacío21. Por ejemplo, muchas fuentes MALDI operan a presiones de 0.1-10 Torr, que es un vacío suficiente para eliminar la humedad del agar y puede causar la deformación de la muestra. Estos cambios morfológicos en el agar inducidos por el ambiente de vacío causan burbujeo y agrietamiento en el material de agar seco. Estos artefactos reducen la adherencia del agar al portaobjetos y pueden causar el desmontaje o la descamación de la muestra en el sistema de vacío del instrumento. El grosor de las muestras de agar puede estar a una distancia de hasta 5 mm del portaobjetos, lo que puede crear un espacio libre insuficiente de la óptica de iones dentro del instrumento, causando contaminación y / o daños a la óptica de iones del instrumento. Estos efectos acumulativos pueden resultar en reducciones de la señal iónica que refleja la topografía de la superficie, en lugar de las interacciones bioquímicas microbianas subyacentes. Las muestras de agar deben secarse homogéneamente y adherirse fuertemente a un portaobjetos de microscopio antes del análisis en vacío.
Este documento demuestra un flujo de trabajo de preparación de muestras para el secado controlado de macrocolonias de cultivo bacteriano cultivadas en medios de agar. Este proceso de secado más lento y de varios pasos (en relación con los informados anteriormente) garantiza que el agar se deshidrate uniformemente al tiempo que minimiza los efectos del burbujeo o agrietamiento de las muestras de agar montadas en portaobjetos de microscopio. Mediante el uso de este método de secado gradual, las muestras se adhieren fuertemente al portaobjetos del microscopio y son susceptibles de aplicación posterior en matriz y análisis MALDI. Esto se ejemplifica utilizando colonias bacterianas modelo de C. difficile cultivadas en agar y modelos de tejido murino que albergan CDI con y sin la presencia del patógeno comensal y oportunista, Enterococcus faecalis. Los análisis de espectrometría de masas de imágenes MALDI de modelos bacterianos y tisulares permiten el mapeo espacial de perfiles de metabolitos de aminoácidos, proporcionando una nueva visión del metabolismo microbiano bioenergético y la comunicación.
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Protocol
NOTA: Los experimentos con animales fueron aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Niños de Filadelfia y la Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania (protocolos IAC 18-001316 y 806279).
PRECAUCIÓN: Clostridium difficile (C. difficile) y Enterococcus faecalis (E. faecalis) son patógenos BSLII y deben manejarse con extrema precaución. Utilice protocolos de descontaminación adecuados cuando sea necesario.
1. Crecimiento de macrocolonias de cultivo bacteriano y preparación para el envío nocturno
- Preparar cultivos de C. difficile y E. faecalis durante la noche y cultivarlos individualmente a 37 °C en una cámara anaeróbica (85% de nitrógeno, 10% de hidrógeno, 5% de dióxido de carbono) en caldo de infusión de cerebro y corazón suplementado con 0,5% de extracto de levadura y 0,1% de l-cisteína (BHIS). Utilice agar al 1,5% para todas las muestras plateadas.
- Normalizar los medios de cultivo bacteriano a densidad óptica a 600 nm (OD600). Placa 5 μL de cada macrocolonia sobre placas de agar BHIS + l-cisteína y crecer anaeróbicamente durante 7 días a 37 °C. Para macrocolonias de especies mixtas, mezclar los medios de cultivo bacteriano en una proporción de 1:1 antes del recubrimiento.
- Prepare portaobjetos de microscopio recubiertos con óxido de indio y estaño (ITO) usando un ohmímetro para identificar el lado del portaobjetos con el recubrimiento conductor. Use un escriba con punta de diamante para grabar y etiquetar el lado recubierto ITO del portaobjetos del microscopio.
- Extirpe todo el cultivo de la placa de crecimiento de agar y luego móntelo en un portaobjetos de microscopio recubierto con ITO mientras se asegura de que las burbujas de aire no queden atrapadas entre el agar y el portaobjetos.
NOTA: El contenido de agua en el medio de agar debe permitir que el cultivo se adhiera naturalmente a la superficie del portaobjetos del microscopio. Un video que ejemplifica este proceso se proporciona en la documentación complementaria de Yang et al.22. - Coloque las colonias en cajas portaobjetos de microscopio para su protección. Guarde las cajas deslizantes en 8 x 8 en bolsas de transporte de muestras de riesgo biológico con un puñado de gránulos desecantes y sello para su envío nocturno para su posterior procesamiento y análisis.
NOTA: Es importante mantener un ambiente seco para los cultivos bacterianos cuando se envían en condiciones ambientales para retardar el crecimiento bacteriano y el metabolismo y mantener la fijación de las muestras bacterianas hasta el análisis. Este método de envío ha sido optimizado a través de extensos experimentos y es preferido sobre el envío de las colonias congeladas en hielo seco. Los cambios importantes de temperatura antes del secado tienden a causar desmontaje y burbujeo debajo de la muestra de agar montada.
2. Secado ambiental de macrocolonias bacterianas de C. difficile + E. faecalis
- Retire las colonias bacterianas de agarosa montadas en portaobjetos de microscopio recubiertos con ITO del material de embalaje. Colocar las muestras en una caja seca con desecante durante 48-72 h a temperatura ambiente.
NOTA: Este es un proceso de secado suave y lento que minimiza el burbujeo, el agrietamiento o el desprendimiento de los medios de agar de la superficie del portaobjetos del microscopio. - Deseche adecuadamente todo el material de embalaje contaminado y descontamine el espacio de trabajo con un desinfectante bactericida/esporicida adecuado.
- Inspeccione visualmente las colonias para detectar deformaciones en la superficie del agar (por ejemplo, burbujeo, agrietamiento, desmontaje).
NOTA: La altura de la superficie de agarosa debe disminuir visiblemente y permanecer plana sobre el portaobjetos.
3. Secado al vacío y mediado por calor de macrocolonias bacterianas de C. difficile + E. faecalis
NOTA: Se construyó un aparato de secado al vacío hecho a medida (Figura 1) para facilitar la eliminación del exceso de humedad de las muestras de agar. Este aparato utiliza una bomba de vacío de paletas rotativas conectada en línea a un biofiltro HEPA, una trampa fría y una cámara de acero inoxidable, donde se colocan las muestras bacterianas. Un transformador de voltaje variable está conectado a un filamento de alambre aislado, que permite al usuario calentar la cámara para acelerar el proceso de secado.
- Cierre la línea de vacío a la cámara de muestras y encienda el interruptor de encendido de la bomba de paletas rotativas para permitir que la bomba de vacío se caliente y alcance la presión de vacío adecuada.
- Encienda el transformador de voltaje variable para calentar el filamento de alambre envuelto alrededor de la cámara. Ajuste la fuente de alimentación variable hasta que la temperatura interna de la cámara de vacío alcance ~50 °C. Mientras la bomba se calienta, coloque una suspensión de hielo seco y etanol 100% en el condensador de la trampa fría.
NOTA: La trampa fría condensa cualquier vapor o espora de la muestra y evita la contaminación del sistema de bomba de paletas rotativas y el aceite de la bomba de vacío. - Abra la cámara de vacío utilizando una llave para aflojar las abrazaderas de brida de doble garra de 16 mm. Inserte las muestras de agarosa en la cámara y selle la cámara herméticamente con las abrazaderas de brida de doble garra de 16 mm.
- Abra la válvula de la bomba para evacuar la cámara. Deje que las muestras se sequen durante 60-120 min (por ejemplo, a ~150 mTorr).
NOTA: Este tiempo de secado es suficiente para eliminar la mayor parte de la humedad en pequeñas secciones de agar. La determinación empírica del tiempo de secado óptimo para la eliminación de humedad y la disminución de la altura del agar puede ser necesaria dependiendo de la configuración individual y las muestras. Los tiempos de secado sustancialmente más largos pueden hacer que el agar seco se vuelva quebradizo y propenso a agrietarse. - Cuando haya terminado, ventile lentamente la cámara de vacío a la presión ambiente cerrando la válvula de la bomba de paletas rotativas y abriendo la válvula externa al aire ambiente. Abra la cámara utilizando el protocolo mencionado anteriormente y retire la muestra de agarosa seca de la cámara.
- Almacene la muestra en una caja seca con desecante hasta la aplicación de la matriz.
NOTA: La Figura 2 muestra imágenes de la superficie de agar antes y después del secado.
4. Aplicación de matriz MALDI mediante pulverización robótica
NOTA: Después de que las muestras de agarosa se hayan secado completamente y la altura de las secciones de cultivo haya disminuido notablemente, use un pulverizador de matriz robótica para aplicar homogéneamente un recubrimiento delgado de un compuesto químico de matriz MALDI. Este procedimiento debe realizarse en una campana extractora de humos químicos y con el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes, gafas de laboratorio y una bata de laboratorio.
- Seleccione la matriz MALDI adecuada. Para seguir este protocolo, utilice la matriz MALDI de 1,5-diaminonaftaleno (DAN) para su desorción e ionización favorable de aminoácidos en modo de iones negativos.
- Preparar 10 ml de una solución de matriz de 10 mg/ml de DAN MALDI en 90/10 (v/v) acetonitrilo/agua. Use solventes de grado HPLC, sonicate durante 30 min y filtre la solución a través de filtros de jeringa de nylon de 0.2 μm antes de la introducción a la bomba de jeringa de pulverización robótica. Además, prepare soluciones de lavado para asegurarse de que la línea del pulverizador esté limpia entre cada uso.
NOTA: Las soluciones de lavado se eligen para aumentar la solubilidad de la matriz y otros contaminantes en la línea de pulverización y facilitar su eliminación del sistema. Las soluciones de lavado utilizadas en este documento son 90/10 (v/v) acetonitrilo/agua, 50/50 (v/v) agua/metanol, 99/1 (v/v) acetonitrilo/ácido acético y 95/5 (v/v) agua/hidróxido de amonio. - Fije la muestra a la bandeja del pulverizador y cargue las soluciones preparadas en la línea del pulverizador (Figura 3). Utilizando el software informático, especifique los parámetros necesarios para permitir un recubrimiento uniforme del compuesto de la matriz: temperatura de la boquilla de 30 °C, ocho pasadas, caudal de 0,1 ml / min, patrón CC, tiempo de secado de 0 s, 10 psi.
NOTA: En general, se acepta que la mayoría de los patógenos se inactivarán mediante la aplicación de la matriz MALDI, que suele ser un pequeño ácido orgánico o base. - Una vez finalizada la secuencia de pulverización, retire la muestra de la bandeja del pulverizador y guárdela en un gabinete de desecación hasta el análisis.
5. Preparación de macrocolonias bacterianas para la adquisición de datos de espectrometría de masas de imágenes MALDI
NOTA: Todos los análisis de espectrometría de masas de imágenes se realizaron utilizando un espectrómetro de masas de resonancia de ciclotrón de iones transformados de Fourier (FTICR). Este instrumento está equipado con un sistema láser Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm).
- Inserte la muestra recubierta de matriz en el adaptador de portaobjetos del microscopio de placa diana MALDI y escriba al menos tres marcadores fiduciarios que abarquen el área de la muestra utilizando marcadores permanentes (Figura 4). Utilice un escáner plano para adquirir una imagen óptica del portaobjetos del microscopio, incluidos los marcadores de referencia.
NOTA: Los marcadores fiduciales permitirán el registro de la imagen óptica a la vista de la cámara MALDI observada en el instrumento. - Defina un método de instrumento MS optimizado para el rango de masa, sensibilidad y resolución deseados, que incluye calibración de masa, ajustes de láser MALDI, parámetros de óptica de iones y condiciones de celda ICR. Para este método, seleccione una ventana de masa de 100 Da de m/z 100 a 200 para el enriquecimiento de señales en fase gaseosa en modo de iones negativos utilizando un enfoque de acumulación continua de iones seleccionados (CASI),23 que abarca los valores m/z de los metabolitos de interés.
- Abra el software de adquisición de imágenes del instrumento y utilice el asistente de configuración para definir el nombre y la ubicación del archivo, el método de adquisición de MS, las regiones de interés que se muestrearán y la resolución espacial de la imagen.
NOTA: Las resoluciones espaciales de 100-300 μm se emplean típicamente para imágenes de macrocolonias bacterianas. - Una vez definidos todos los parámetros, inicie la secuencia de adquisición para adquirir en serie un espectro de masas en cada píxel a través de la(s) región(es) definida(s) de interés.
NOTA: El tiempo de adquisición de imágenes depende de la configuración del instrumento, pero normalmente oscila entre 2 y 6 h para imágenes que contienen 5.000-10.000 píxeles.
6. Análisis de datos de espectrometría de masas de imágenes e identificación de compuestos
- Después de la adquisición de imágenes, guarde los datos con una extensión de archivo ".mis", que es un formato de archivo específico del proveedor para plataformas de espectrometría de masas de imágenes. Abra el archivo de datos en paquetes de software flexImaging o SCiLS o expórtelo a un formato de datos no propietario como .mzml y visualícelo utilizando software independiente del proveedor (por ejemplo, Cardinal24 o MSIreader25,26).
NOTA: Se muestra un espectro de masas promedio al abrir los datos de imágenes en flexImaging, que representa las intensidades promedio de todos los iones detectados en las regiones muestreadas. Los picos de interés se pueden identificar tentativamente en función de mediciones de masa precisas. Típicamente, las precisiones de masa de más de 5 partes por millón (ppm) son suficientes para la identificación de metabolitos en los espectrómetros de masas FITCR. - Usando el software de referencia, defina ventanas de masa para picos de interés para generar mapas de calor en falso color de distribuciones de iones en las regiones muestreadas.
- En la pantalla de espectro de masas promedio , amplíe el pico de interés y seleccione una ventana de masa adecuada que abarque el área del perfil del pico.
- Haga clic derecho en la ventana de masa resaltada y seleccione Agregar filtro de masa.... Etiquete el valor m/z seleccionado utilizando la identificación tentativa para el metabolito sospechoso según lo determinado por la medición de masa precisa de alta resolución.
- Seleccione el umbral de intensidad para ajustar el rango dinámico de la imagen de analito mostrada por el mapa de calor de color falso. Ajuste aún más los parámetros de filtrado de masa para que la ventana de masa abarque el área del perfil de pico y, a continuación, agregue el filtro de masa.
NOTA: La normalización de la intensidad se puede realizar según corresponda para mejorar la cuantificación relativa entre las regiones medidas. Los experimentos en este documento utilizaron la adquisición de datos CASI (ver infra), que puede hacer que el recuento total de iones (TIC) y los métodos de normalización de la raíz cuadrática media (RMS) sean inexactos. Como tal, todas las imágenes de iones que se muestran aquí se muestran sin normalización.
7. Preparación y envío de tejidos cecales de ratón no infectados con control y C. difficile
- Inocular ratones machos C57BL/6 de 4-8 semanas de edad con antibióticos (0,5 mg/ml de cefoperazona o 0,5 mg/ml de cefoperazona + 1 mg/ml de vancomicina) en agua potable ad libitum durante 5 días, seguido de un período de recuperación de 2 días y la infección posterior.
- Eutanasia a los animales por asfixia deCO2 y cosechar el órgano ciego del ratón inmediatamente. Incrustar en una mezcla al 20% de compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en agua destilada.
- Coloque las muestras en hielo seco y luego empaque y envíelas para su análisis; conservar a -80 °C hasta el análisis.
8. Criosección de tejidos cecales de ratón infectados con Verus C. difficile no infectados
- Limpie todo el equipo de criosección enjuagando con etanol al 100% y deje secar antes de colocar muestras en la cámara de criostato. Prepare portaobjetos de microscopio recubiertos con ITO utilizando un ohmímetro para identificar el lado del portaobjetos con el recubrimiento conductor. Use un escriba con punta de diamante para grabar y etiquetar el lado recubierto ITO del portaobjetos del microscopio.
NOTA: Se debe usar el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes, gafas de laboratorio, una bata de laboratorio y mangas de criostato. - Realizar criosección en un criomicrotomo de investigación. Transfiera los tejidos de ceca de ratón embebidos en OCT de un congelador de -80 °C a la cámara de criomicrotomo (temperatura de la cámara de 30 °C, temperatura del objeto de -28 °C) en hielo seco. Monte las muestras de tejido que se compararán utilizando espectrometría de masas de imágenes (por ejemplo, control no infectado vs. infectado por C. difficile) en el mismo portaobjetos de microscopio para garantizar una preparación de muestras idéntica de ambos tipos de tejido y permitir comparaciones precisas de metabolitos.
- Dentro de la cámara de criomicrotomo, monte el tejido incrustado en OCT en un mandril de muestra utilizando una solución OCT adicional. Después de que la solución OCT se haya solidificado, fije el mandril a la cabeza de la muestra. Comience la criosección en incrementos de 10-50 μm para alcanzar la profundidad / plano de tejido deseado del órgano.
- Una vez que se alcanza una sección transversal óptima del tejido, comience a recolectar secciones a 12 μm de espesor. Manipule suavemente la rebanada con pinceles de artista y colóquela en un portaobjetos de microscopio recubierto de teflón.
- Haga rodar el portaobjetos del microscopio recubierto con ITO sobre la sección de tejido para recoger el tejido del portaobjetos recubierto de teflón. Descongele el montaje de la sección de tejido en el portaobjetos del microscopio presionando la palma de la mano en la parte posterior del portaobjetos recubierto con ITO. Continúe descongelando el montaje hasta que la sección de tejido pase de translúcida a una textura opaca/mate.
- Transfiera los portaobjetos del microscopio montados en tejido sobre hielo seco a una caja seca con desecante para su almacenamiento para el análisis el mismo día, o guárdelos a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
9. Preparación de tejidos cecales de ratón infectados con C. difficile para aplicación en matriz y espectrometría de masas de imágenes MALDI
- Realice la aplicación de la matriz MALDI utilizando el mismo protocolo descrito en el paso 4 (temperatura de la boquilla de 30 ° C, ocho pasadas, caudal de 0,1 ml / min, patrón CC, tiempo de secado de 0 s, 10 psi).
- Realice espectrometría de masas de imágenes MALDI utilizando los mismos protocolos descritos en los pasos 5 y 6.
- Analice las imágenes de iones de múltiples réplicas biológicas y compare los resultados para determinar su importancia a través de comparaciones de diagramas de caja de intensidad utilizando el software estadístico SCiLS mencionado anteriormente.
NOTA: Las pruebas y comparaciones estadísticas apropiadas dependerán de la aplicación y pueden incluir segmentación espacial, modelos de clasificación y análisis comparativo para determinar características espectrales discriminatorias y correlacionadas. Los análisis comparativos pueden incluir la asignación de valores p a características significativas, la generación de análisis de componentes principales para comparaciones de tejidos y la visualización de diagramas de caja para identificar variaciones. También es útil visualizar el tejido utilizando microscopía de campo claro de la sección de tejido teñida a través de hematoxilina y eosina (H&E) después de la espectrometría de masas de imágenes. Esto permite una identificación clara de las características morfológicas en el tejido y se puede analizar en consulta con un patólogo capacitado.
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Representative Results
Hemos realizado espectrometría de masas de imágenes MALDI de metabolitos de colonias bacterianas modelo y ratones cocolonizados con E. faecalis y C. difficile para estudiar el papel de los aminoácidos en las interacciones microbio-microbio. Las macrocolonias bacterianas cultivadas en agar sirven como un modelo bien definido para analizar distintos cambios bioquímicos en la formación de biopelículas bacterianas. Es importante asegurar un proceso de secado controlado para las macrocolonias de cultivo bacteriano cultivadas en medios de agar para minimizar las deformaciones y el agrietamiento en la superficie del agar. Esto se logró a través de un proceso de dos pasos, que implica un secado preliminar con desecante a temperatura y presión ambiente, seguido de un paso de secado asistido por vacío más rápido realizado a una temperatura elevada. Se utilizó un aparato de secado hecho a medida para facilitar la deshidratación del agar mientras se captura la liberación de cualquier contaminante bacteriano o esporas de las muestras (Figura 1). El paso adicional de secado al vacío es necesario para garantizar que las muestras estén completamente deshidratadas y no sufran deformación tras la exposición al vacío MS.
Las secciones de agar fueron inicialmente de 2-4 mm de altura de muestra (Figura 2A) y se redujeron a ~0.5 mm de altura siguiendo el protocolo de secado (Figura 2B). Es importante garantizar un secado uniforme en toda la superficie de la muestra durante este protocolo de preparación de muestras. Las grandes variaciones en la altura de la muestra darán como resultado un rayo láser MALDI desenfocado en la superficie de la muestra, lo que puede afectar negativamente la eficiencia de ionización y la intensidad del ion del analito resultante. Un ejemplo de un proceso de secado fallido se muestra en la Figura 2D, donde la superficie del agar ha burbujeado y agrietado, haciendo que la muestra sea inutilizable para su posterior análisis. Una vez que la muestra bacteriana se ha secado completamente, se aplica una capa de matriz DAN MALDI utilizando un pulverizador robótico (Figura 3). Este instrumento permite el control preciso de los parámetros de pulverización, lo que permite la aplicación de un recubrimiento de matriz uniforme (Figura 2C).
Después de la aplicación de la matriz, los portaobjetos del microscopio que contienen las muestras se insertan en un adaptador de portaobjetos para su análisis en un FTICR MS (Figura 4). Las coordenadas en la diapositiva se registran entre el software de adquisición de espectrometría de masas de imágenes y la cámara del instrumento dibujando primero marcas fiduciales en la diapositiva alrededor de las regiones a medir (denotadas por los símbolos "+" en la Figura 4). A continuación, la diapositiva se escanea digitalmente utilizando un escáner plano para grabar una imagen óptica, que luego se utiliza para definir la secuencia de adquisición en el software flexImaging. Optimizamos la configuración del instrumento de espectrometría de masas para la transmisión y detección de aniones metabolitos. Utilizando el enriquecimiento iónico en fase gaseosa CASI, se definió una ventana de aislamiento iónico para acumular iones selectivamente a m/z 150 ± 50 Da (Figura 5A), que contiene una serie de compuestos observados desde la superficie del tejido. Específicamente aquí para la infección por C. difficile, encontramos vías de aminoácidos para demostrar roles interesantes y cambiantes durante el catabolismo bacteriano. Sobre la base de mediciones de masa precisas, las señales de iones se identificaron en m/z 131.083 y m/z 173.104 como ornitina (0.34 ppm de error de masa; Figura 5B) y arginina (0,43 ppm de error de masa; Figura 5C), respectivamente.
La espectrometría de masas de imágenes de macrocolonias bacterianas se realizó en monocultivos de C. difficile y en colonias de cocultivo de C. difficile + E. faecalis (Figura 6). Una imagen óptica de las muestras después de la aplicación de la matriz MALDI destaca las regiones de adquisición de interés, que se extienden a las áreas externas de las biopelículas de colonias (Figura 6A, C). La espectrometría de masas de imágenes de estas muestras permite el mapeo espacial de los metabolitos de aminoácidos de ornitina y arginina, que se encuentran alterados y localizados diferencialmente en presencia de E. faecalis (Figura 6B, D). Por ejemplo, la arginina es significativamente más abundante en el monocultivo de C. difficile en comparación con el cocultivo de C. difficile + E. faecalis (Figura 6D). También hemos extendido los análisis de espectrometría de masas de imágenes a modelos de ratón de infección utilizando ratones hembra C57BL / 6 libres de gérmenes de 8 semanas de edad que fueron infectados con esporas de C. difficile, tanto esporas de C. difficile + células de E. faecalis (wt) (5 × 10 8 / ml), o un mutante de transposón que contiene esporas de C. difficile + células de E. faecalis (mutante ArcD) (5 × 10 8 / ml) (Figura 7)27 . El ciego de ratón se recolectó y congeló en un compuesto OCT al 25% para mantener la forma y fidelidad del órgano. El compuesto OCT también ayudó a soportar las secciones de tejido delgado durante la criosección. Similar al protocolo mencionado anteriormente, las secciones de tejido se recubren con una capa de matriz DAN MALDI, se escanean con un escáner óptico plano (Figura 7B) y se analizan mediante espectrometría de masas de imágenes MALDI (Figura 7C). Se realizó tinción histológica en secciones de tejido después del análisis de espectrometría de masas de imágenes, y se empleó escaneo óptico de campo claro de alta resolución para evaluar la morfología del tejido (Figura 7A). La capa de células epiteliales está claramente inflamada durante la infección en comparación con el tejido de control.
Figura 1: Aparato de secado al vacío hecho en casa. Se utiliza un aparato de secado al vacío hecho a medida para acelerar la eliminación de humedad de las muestras de agar. Las muestras se colocan en la cámara de vacío, que se sella y evacua con una bomba de paletas rotativas, y luego se calienta con un transformador de voltaje variable. Cualquier vapor/espora contaminante de la muestra queda atrapado en la trampa fría y en los filtros en línea HEPA. Normalmente se emplean presiones de 100-150 mTorr. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Secado y preparación de macrocolonias bacterianas. Imágenes ópticas de muestras de agar (A) antes y (B) después de la eliminación de humedad mediante desecación y secado asistido por vacío. (C) Se aplica una matriz MALDI de 1,5-diaminonaftaleno al cocultivo bacteriano después del secado utilizando un pulverizador robótico. (D) El secado fallido generalmente resulta en grietas y burbujeos dentro del agar, haciéndolo inutilizable para un análisis posterior. Abreviaturas: DAN = 1,5-diaminonaftaleno; MALDI = desorción/ionización láser asistida por matriz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pulverización robótica de matriz MALDI en muestras de agarosa. Imágenes de (A) un pulverizador HTX M5 TM y (B) muestras de agarosa cargadas en el pulverizador de matriz robótica para la aplicación de matriz MALID. Abreviatura: MALDI = desorción/ionización láser asistida por matriz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Adaptador del espectrómetro de masas con muestras cargadas para su análisis. Las muestras de agarosa recubiertas de matriz se cargan en un adaptador de portaobjetos MTP para el análisis MALDI. Los marcadores de referencia son visibles como signos más negros ("+"). Abreviatura: MALDI = desorción/ionización láser asistida por matriz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Espectros de masas representativos de picos de iones metabolitos identificados. (A) El análisis MALDI en modo de iones negativos de muestras de cultivo bacteriano permite la detección de docenas de metabolitos. Las mediciones de masa precisas de alta resolución permiten la identificación tentativa de (B) ornitina a m/z 131.083 (0.34 ppm de error de masa) y (C) arginina a m/z 173.104 (0.43 ppm de error de masa). Los espectros de masas se adquieren utilizando un poder de resolución de masas (FWHM) de 75.000 a m/z 150. Abreviaturas: MALDI = desorción/ionización láser asistida por matriz; FWHM = ancho completo a la mitad máximo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis de espectrometría de masas de imágenes de macrocolonias bacterianas. (A,C) Las imágenes ópticas de muestras de agarosa muestran las regiones de medición para el análisis de espectrometría de masas de imágenes, que se resaltan con líneas discontinuas blancas. (B,D) Las imágenes de iones MALDI para ornitina (m/z 131.083, 0.038 ppm) y arginina (m/z 173.104, 0.60 ppm) muestran distribuciones espaciales únicas a través de los cultivos bacterianos. Tenga en cuenta que las escalas de intensidad absoluta son diferentes para las imágenes de iones de cocultivo que se muestran en los paneles B y D. Por ejemplo, la arginina es significativamente más abundante en el monocultivo de C. difficile en relación con el cocultivo en los paneles C y D, lo que significa que esta escala de intensidad es relativa a la abundancia de arginina en el monocultivo, y parece que no hay arginina presente en este cocultivo. Por el contrario, el cocultivo en A y B proyecta la intensidad de la arginina en una escala de intensidad absoluta más baja, ya que esta es la única muestra en la imagen. Abreviaturas: MALDI = desorción/ionización láser asistida por matriz; CASI = acumulación continua de iones seleccionados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis por espectrometría de masas de imágenes de tejidos cecales murinos infectados. (A) Las imágenes de microscopía de campo claro de hematoxilina y tejidos teñidos con eosina de ceca de ratón infectado permiten la visualización de la morfología del tejido. (B) Las imágenes ópticas de tejidos de ceca de ratón muestran las muestras después de la aplicación de una capa de matriz DAN MALDI. (C) Las imágenes de iones MALDI para ornitina (m/z 131.083, 0.88 ppm) y arginina (m/z 173.104, 0.15 ppm) muestran distribuciones espaciales únicas a través de las muestras de tejido. Abreviaturas: MALDI = desorción/ionización láser asistida por matriz; DAN = 1,5-diaminonaftaleno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Durante la espectrometría de masas de imágenes MALDI, es importante tener una superficie de muestra plana para proporcionar un diámetro focal consistente del láser MALDI incidente en el sustrato de la muestra. Las desviaciones en la altura de la muestra pueden hacer que el rayo láser MALDI se desenfoque, causando alteraciones en el diámetro y la intensidad del haz, lo que puede afectar la eficiencia de ionización MALDI. Estas alteraciones en la eficiencia de ionización pueden dar lugar a diferencias en la intensidad del analito a través de la superficie del tejido que no reflejan la bioquímica tisular subyacente, sino que reflejan la topografía de la superficie. Además, la mayoría de las fuentes de ionización MALDI operan a presiones subatmosféricas, y las muestras de agar hidratado son muestras frágiles cuando se someten a condiciones de vacío . El vacío de estas fuentes puede causar deshidratación de las muestras de agarosa, lo que puede alterar la superficie de la muestra durante el secado. Las muestras que contienen bolsas de aire o grandes cantidades de agua son altamente susceptibles a estos cambios. Este problema se encuentra comúnmente durante el análisis de espectrometría de masas de imágenes MALDI de muestras bacterianas cultivadas en agar. El agar nutriente tiene un alto contenido de agua para facilitar el crecimiento bacteriano; sin embargo, es esencial eliminar la mayor cantidad de humedad posible antes de aplicar un recubrimiento de matriz MALDI e introducir la muestra al vacío del espectrómetro de masas.
Por lo tanto, las muestras de agar hidratado no son propicias para el análisis in vacuo . Además de los cambios morfológicos inducidos por las condiciones de vacío, también existen problemas potenciales con las alturas de muestra que sobresalen demasiado lejos del adaptador de portaobjetos de placa objetivo MALDI, que se utiliza para sostener la muestra montada en portaobjetos del microscopio y llevarla a la posición adecuada para el punto focal láser MALDI. El mecanismo de la etapa MALDI se infiere firmemente con otros componentes mecánicos de la etapa, y mientras está en posición, hay un espacio libre de solo unos pocos milímetros entre la superficie de la placa objetivo de muestra y el extremo frontal de la óptica de la fuente de iones. Esto puede causar raspado de la muestra, que puede mover o desmontar completamente la muestra a analizar. Además, mientras que las muestras de agar hidratadas se adhieren naturalmente a una superficie de portaobjetos de microscopio, esto tiende a ser mucho más débil que la adherencia de una muestra de agar completamente seca. Por lo tanto, las muestras de agar hidratado sobresalen más de la superficie de la placa objetivo de la muestra y tienen una adherencia más débil, lo que causa un mayor riesgo de que la muestra se desmonte y se descascara en la óptica de iones del instrumento aguas abajo.
La identidad de la matriz MALDI y la selección del método de aplicación también son variables importantes a considerar en un experimento de espectrometría de masas de imágenes. La selección de una matriz orgánica MALDI depende en gran medida del sustrato de la muestra y de los compuestos objetivo de interés. Por ejemplo, muchos metabolitos de bajo peso molecular (MW < 300 Da) están compuestos de muchos ácidos orgánicos, fosfatos y otras mitades, que se ionizan más fácilmente en la polaridad negativa28. Para el análisis de modo negativo, se prefieren matrices básicas, de modo que sus estructuras químicas sean más susceptibles de aceptar un protón (por ejemplo, 9-aminoacridina, 1,5-diaminonaftaleno), dejando así una carga negativa en muchos iones de metabolitos pequeños de interés. Realizamos un cribado matricial para los analitos específicos de interés y encontramos que la matriz de 1,5-diaminonaftaleno (DAN) produjo la señal más alta para metabolitos de aminoácidos de interés para muestras de tejido control. Durante la aplicación de la matriz MALDI, los analitos de interés se extraen del sustrato de la muestra y se cocristalizan con la matriz MALDI. En algunos casos, las condiciones de aplicación de la matriz "más húmeda" facilitarán una mayor extracción y cocristalización, lo que resultará en una mejor detección de analitos en el análisis MALDI. Sin embargo, si el proceso de aplicación de la matriz utiliza demasiado disolvente, los analitos pueden deslocalizarse dentro del tejido. Es importante lograr un equilibrio entre la extracción efectiva del analito y el mantenimiento de la fidelidad espacial de los analitos en el tejido al seleccionar las condiciones para la aplicación de la matriz. Por ejemplo, se puede utilizar un aparato de sublimación hecho a medida para aplicar una capa de matriz homogénea a superficies de muestra y produce tamaños de cristal de matriz extremadamente pequeños29,30. Sin embargo, este proceso es bastante seco y puede no ser óptimo para la extracción de analitos31. El pulverizador robótico utilizado aquí proporciona un control reproducible y preciso de la presión de pulverización, el caudal, la temperatura de la boquilla y otros parámetros que pueden permitir métodos optimizados de extracción de analitos y cocristalización de la matriz32.
Los parámetros instrumentales en el FTICR MS utilizados aquí se han optimizado para la transmisión y detección de iones metabolitos en modo de iones negativos. Esto incluye ajustar elementos de RF y DC en la región de transferencia de iones para transmitir preferentemente iones de bajo peso molecular (<m / z 200). Los parámetros que tienen un gran efecto en la transmisión de iones incluyen la amplitud de RF del embudo (65 V), el ajuste de masa Q1 para el aislamiento de iones del filtro de masa cuadrupolo (m / z 150) y el retraso de tiempo de vuelo entre la celda de acumulación hexapolar y la celda ICR (0.400 ms). Estos valores de parámetros seleccionados transmiten de manera más eficiente iones de valores m / z bajos a expensas de las eficiencias de transmisión de iones de valores m / z más grandes. Además, hemos utilizado un enfoque de acumulación continua de iones seleccionados (CASI), que permite el enriquecimiento selectivo de iones en una ventana de masa definida de interés. En este enfoque, el filtro de masa cuadrupolo se utiliza para transmitir selectivamente un pequeño rango de valores m / z desde la fuente de ionización a la celda de acumulación hexapolar en el instrumento, mientras que los iones con valores m / z fuera de esta ventana de masa tienen trayectorias de iones inestables y no se transmiten a través del filtro de masa cuadrupolo. Esto permite el enriquecimiento selectivo de analitos de interés poco abundantes para mejorar el límite de detección y el rango dinámico hasta en tres órdenes de magnitud mediante la eliminación del ruido químico. El alto poder de resolución de masa y la precisión de masa de la plataforma de instrumentos FTICR permiten la fácil separación de compuestos isobáricos (es decir, la misma masa nominal) y la identificación tentativa de metabolitos.
El control cuidadoso y reproducible de la preparación de muestras, la aplicación de la matriz MALDI y los análisis de espectrometría de masas de imágenes pueden permitir vistas reproducibles de la bioquímica bacteriana en colonias y muestras de tejido. Las macrocolonias bacterianas sirven como modelos simplificados para caracterizar la comunicación cruzada metabólica de patógenos durante la infección microbiana, que luego se puede comparar con sistemas más complejos como los tejidos animales. Por ejemplo, se encuentra que la arginina es poco abundante en la muestra de cocultivo de C. difficile + E. faecalis en comparación con el cultivo de C. difficile solo (Figura 6), que está respaldado por la capacidad observada de E. faecalis para consumir arginina como fuente de energía y exportar ornitina de la célula a través del antiportador ArcD33. Los resultados de la macrocolonia condujeron a la investigación de esta regulación de aminoácidos en un modelo animal. Los ratones infectados con C. difficile + E. faecalis (wt) mostraron significativamente menos arginina que los ratones infectados con C. difficile solo (Figura 7C), recapitulando los resultados de la imagen de la colonia.
Para probar la hipótesis del metabolismo de la arginina y la participación del antiportador ArcD, hemos utilizado un mutante transposón que elimina el transporte de metabolitos a través del antiportador ArcD de E. faecalis. Los ratones infectados con C. difficile + E. faecalis (arcD::Tn) muestran un aumento en la detección de arginina y una disminución en la detección de ornitina en relación con el modelo de coinfección de tipo salvaje (Figura 7C) y generalmente rescatan los niveles originales de aminoácidos observados en el modelo de infección por C. difficile solo (Figura 7A). Esta relación inversa de la regulación de metabolitos corrobora los hallazgos de que E. faecalis se alimenta de nutrientes de aminoácidos producidos a partir de C. difficile. Además, el análisis histológico mostró un daño celular extenso en ratones infectados con C. difficile y E. faecalis, que se observa principalmente en la cepa de tipo salvaje de E. faecalis opuesta al mutante transposón ArcD. Estos resultados respaldan nuestros hallazgos recientes de que la arginina y la ornitina son clave para la virulencia, el comportamiento y la virulencia de C. difficile.
Aptitud física27. En general, este flujo de trabajo demuestra un método eficaz para preparar macrocolonias bacterianas a base de agar para la espectrometría de masas de imágenes MALDI y muestra que estos sistemas pueden servir como modelos útiles para examinar la cooperación microbiana durante la infección.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) bajo el premio GM138660. J.T.S. fue apoyado por la beca de verano de la familia Charles y Monica Burkett de la Universidad de Florida. J.P.Z. fue apoyado por las subvenciones de los NIH K22AI7220 (NIAID) y R35GM138369 (NIGMS). A.B.S. fue apoyado por la Beca de Capacitación en Biología Celular y Molecular de la Universidad de Pensilvania (T32GM07229).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
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