חקירת שיתוף פעולה מיקרוביאלי באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה של מושבות חיידקים הגדלות על אגר וברקמות במהלך זיהום
Summary
שיטת הכנת דגימות חדשנית מודגמת לניתוח של מקרוקולוניות חיידקים מבוססות אגר באמצעות ספקטרומטריית מסה של הדמיית ספיחה / יינון בלייזר בסיוע מטריצה.
Abstract
הבנת ההשלכות המטבוליות של אינטראקציות מיקרוביאליות המתרחשות במהלך זיהום מציבה אתגר ייחודי לתחום הדימות הביו-רפואי. ספקטרומטריית מסות הדמיה בסיוע לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) מייצגת שיטת הדמיה באתרה נטולת תוויות המסוגלת ליצור מפות מרחביות עבור מגוון רחב של מטבוליטים. בעוד שדגימות רקמה בחתך דק מנותחות כיום באופן שגרתי באמצעות טכנולוגיה זו, ניתוחי ספקטרומטריית מסות הדמיה של מצעים לא מסורתיים, כגון מושבות חיידקים הגדלות בדרך כלל על אגר במחקר מיקרוביולוגי, נותרו מאתגרים בשל תכולת המים הגבוהה והטופוגרפיה הלא אחידה של דגימות אלה. מאמר זה מדגים זרימת עבודה להכנת דגימות כדי לאפשר ניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה של סוגי דגימות אלה. תהליך זה מודגם באמצעות מושבות מקרו-מושבות של תרבית חיידקית משותפת של שני פתוגנים במערכת העיכול: Clostridioides difficile ו- Enterococcus faecalis. חקר אינטראקציות מיקרוביאליות בסביבת אגר מוגדרת היטב זו הוכח גם כמשלים מחקרי רקמות שמטרתם להבין שיתוף פעולה מטבולי מיקרוביאלי בין שני אורגניזמים פתוגניים אלה במודלים של זיהום בעכברים. ניתוחי ספקטרומטריית מסה של המטבוליטים של חומצות האמינו ארגינין ואורניתין מוצגים כנתונים מייצגים. שיטה זו ישימה באופן נרחב לאנליטים אחרים, פתוגנים מיקרוביאליים או מחלות, וסוגי רקמות שבהם נדרשת מידה מרחבית של ביוכימיה תאית או רקמתית.
Introduction
המיקרוביום האנושי הוא מערכת אקולוגית דינמית ביותר הכוללת אינטראקציות מולקולריות של חיידקים, נגיפים, ארכאה ואיקריוטים מיקרוביאליים אחרים. בעוד שיחסים מיקרוביאליים נחקרו באינטנסיביות בשנים האחרונות, עדיין ניתן להבין הרבה על תהליכים מיקרוביאליים ברמה הכימית 1,2. זה נובע בחלקו מחוסר הזמינות של כלים המסוגלים למדוד במדויק סביבות מיקרוביאליות מורכבות. ההתקדמות בתחום ספקטרומטריית מסות הדמיה (IMS) בעשור האחרון אפשרה מיפוי מרחבי באתרו וללא תוויות של מטבוליטים, שומנים וחלבונים רבים במצעים ביולוגיים 3,4. ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) התפתחה כטכניקת היינון הנפוצה ביותר המשמשת בספקטרומטריית מסות הדמיה, הכוללת שימוש בלייזר UV כדי לעבד חומר מפני השטח של קטע רקמה דק למדידה על ידי ספקטרומטריית מסה4. תהליך זה מתאפשר על ידי יישום מטריצה כימית המיושמת באופן הומוגני על פני השטח של הדגימה, ומאפשרת לבצע מדידות רציפות בתבנית רסטר על פני שטח הדגימה. מפות חום של עוצמות יונים אנליטיות נוצרות לאחר מכן לאחר איסוף נתונים. ההתקדמות האחרונה במקורות יינון וטכניקות דגימה אפשרה ניתוח של מצעים לא מסורתיים כגון חיידקים5 ויונקים 6,7,8 דגימות תאיות שגדלו על אגר מזין. המידע המולקולרי המרחבי המסופק על ידי IMS יכול לספק תובנה ייחודית לגבי התקשורת הביוכימית של אינטראקציות מיקרוב-מיקרוב ומיקרובים מארחים במהלך זיהום 9,10,11,12,13,14.
עם זיהום Clostridioides difficile (CDI), C. difficile נחשף לסביבה מיקרוביאלית המשתנה במהירות במערכת העיכול, שבה אינטראקציות מיקרוביאליות צפויות להשפיע על תוצאות זיהום15,16. באופן מפתיע, מעט ידוע על המנגנונים המולקולריים של אינטראקציות בין C. difficile לבין מיקרוביוטה תושב במהלך זיהום. לדוגמה, אנטרוקוקים הם קבוצה של פתוגנים אופורטוניסטיים במיקרוביום המעי ונקשרו לרגישות מוגברת ולחומרה של CDI17,18,19,20. עם זאת, מעט ידוע על המנגנונים המולקולריים של האינטראקציות בין פתוגנים אלה. כדי להמחיש תקשורת של מולקולות קטנות בין החברים האלה במיקרוביום המעי, מקרו-מושבות חיידקים גודלו כאן על אגר כדי לדמות אינטראקציות מיקרואורגניזם והיווצרות ביופילם חיידקי בסביבה מבוקרת. עם זאת, השגת התפלגות מטבולית מייצגת בניתוח ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI של דגימות תרבית חיידקים היא מאתגרת בשל תכולת המים הגבוהה וטופוגרפיית פני השטח הלא אחידה של דגימות אלה. זה נגרם בעיקר על ידי האופי ההידרופילי מאוד של אגר ואת התגובה משטח אגר לא אחיד במהלך הסרת לחות.
תכולת המים הגבוהה של אגר יכולה גם להקשות על השגת ציפוי מטריצת MALDI הומוגני ויכולה להפריע לניתוח MALDI הבא שבוצע ב- vacuo21. לדוגמה, מקורות MALDI רבים פועלים בלחצים של 0.1-10 Torr, שהוא ואקום מספיק כדי להסיר לחות מהאגר ויכול לגרום לעיוות של הדגימה. שינויים מורפולוגיים אלה באגר הנגרמים על ידי סביבת הוואקום גורמים לבעבוע וסדקים בחומר האגר המיובש. ממצאים אלה מפחיתים את ההיצמדות של האגר למגלשה ויכולים לגרום לפירוק או התקלפות של הדגימה לתוך מערכת ואקום המכשיר. עובי דגימות האגר יכול להיות עד 5 מ”מ מהמגלשה, מה שעלול ליצור מרווח לא מספיק מאופטיקת היונים בתוך המכשיר, ולגרום לזיהום ו/או נזק לאופטיקה של יונים במכשיר. השפעות מצטברות אלה יכולות לגרום להפחתה של אות היונים המשקף את טופוגרפיית פני השטח, במקום את האינטראקציות הביוכימיות המיקרוביאליות הבסיסיות. דגימות אגר חייבות להיות מיובשות בצורה הומוגנית ולהיות מודבקות בחוזקה לשקופית מיקרוסקופ לפני ניתוח בחלל ריק.
מאמר זה מדגים תהליך הכנה לדוגמה לייבוש מבוקר של מושבות מאקרו בתרבית חיידקים הגדלות על מצע אגר. תהליך ייבוש רב שלבי ואיטי זה (יחסית לאלה שדווחו בעבר) מבטיח כי האגר יתייבש באופן אחיד תוך מזעור ההשפעות של בעבוע או פיצוח של דגימות אגר המותקנות על שקופיות מיקרוסקופ. על ידי שימוש בשיטת ייבוש הדרגתית זו, הדגימות נצמדות מאוד לשקופית המיקרוסקופ וניתנות ליישום מטריצה עוקב ולניתוח MALDI. הדבר מודגם באמצעות מושבות חיידקים מודל של C. difficile הגדלות על מודלים של רקמת אגר ומורין המכילות CDI עם וללא נוכחות של פתוגן קומנסלי ואופורטוניסטי, Enterococcus faecalis. ניתוח ספקטרומטריית מסה של MALDI של מודלים חיידקיים ורקמתיים מאפשר מיפוי מרחבי של פרופילי מטבוליטים של חומצות אמינו, ומספק תובנה חדשה לגבי מטבוליזם מיקרוביאלי ביו-אנרגטי ותקשורת.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך ספקטרומטריית מסות הדמיית MALDI, חשוב שיהיה משטח דגימה שטוח כדי לספק קוטר מוקד עקבי של לייזר MALDI האירוע על מצע הדגימה. סטיות בגובה הדגימה עלולות לגרום לקרן הלייזר MALDI לצאת מהמיקוד, ולגרום לשינויים בקוטר הקרן ובעוצמה, שיכולים להשפיע על יעילות היינון של MALDI. שינויים אלה ביעילות היינון יכול?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (NIGMS) תחת הפרס GM138660. J.T.S. נתמך על ידי מלגת הקיץ של משפחת צ’ארלס ומוניקה בורקט מאוניברסיטת פלורידה. J.P.Z. נתמך על ידי מענקי NIH K22AI7220 (NIAID) ו- R35GM138369 (NIGMS). ABS נתמך על ידי מענק הכשרה לביולוגיה תאית ומולקולרית באוניברסיטת פנסילבניה (T32GM07229).
Materials
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
References
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
- Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
- Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
- Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313 (2014).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490 (2019).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nature Reviews Microbiology. 9 (9), 683-694 (2011).
- Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
- Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
- Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
- Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951 (2016).
- Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
- Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
- Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387 (2020).
- Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
- Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869 (2020).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
- Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
- Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
- Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
- Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
- Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
- Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
- Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , (2014).
