Summary

מודל שריפת חולדות לחקר כוויה תרמית עורית בעובי מלא וזיהום

Published: August 23, 2022
doi:

Summary

מודל המחקה את התרחיש הקליני של פגיעה בכוויות וזיהום נחוץ לקידום מחקר הכוויות. הפרוטוקול הנוכחי מדגים מודל פשוט וניתן לשחזור של זיהום כוויות חולדות הדומה לזה שבבני אדם. זה מקל על המחקר של כוויות וזיהומים לאחר כוויה לפיתוח טיפולים אנטיביוטיים מקומיים חדשים.

Abstract

מתודולוגיות השראת שריפה מתוארות באופן לא עקבי במודלים של חולדות. מודל אחיד של פצעי כוויה, המייצג את התרחיש הקליני, נחוץ לביצוע מחקר כוויות הניתן לשחזור. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה וניתנת לשחזור ליצירת ~20% כוויות בעובי מלא של שטח הגוף הכולל (TBSA) בחולדות. כאן, מוט נחושת בקוטר 22.89 ס”מ 2 (5.4ס” מ) שחומם ב 97 מעלות צלזיוס באמבט מים הוחל על פני העור של החולדה כדי לגרום לפציעת הכוויה. מוט נחושת בעל מוליכות תרמית גבוהה הצליח לפזר את החום עמוק יותר ברקמת העור וליצור כוויה בעובי מלא. ניתוח היסטולוגיה מראה אפידרמיס מוחלש עם נזק קוגולטיבי להיקף עובי מלא של הדרמיס והרקמה התת עורית. בנוסף, מודל זה מייצג את המצבים הקליניים שנצפו בחולי כוויות מאושפזים לאחר פגיעה בכוויות כגון חוסר ויסות חיסוני וזיהומים חיידקיים. המודל יכול לשחזר את הזיהום החיידקי המערכתי הן על ידי חיידקים גראם-חיוביים והן על ידי חיידקים גראם-שליליים. לסיכום, מאמר זה מציג מודל קל ללמידה וחזק של כוויות חולדות המחקה את המצבים הקליניים, כולל חוסר ויסות חיסוני וזיהומים חיידקיים, אשר מועיל רבות לפיתוח תרופות אנטיביוטיות מקומיות חדשות לפצעי כוויות וזיהומים.

Introduction

פציעות כוויות הן בין צורות הטראומה ההרסניות ביותר, כאשר שיעורי התמותה מגיעים ל -12% אפילו במרכזי כוויות מיוחדים 1,2,3. על פי דיווחים שפורסמו לאחרונה, ~ 486,000 חולי כוויות זקוקים לטיפול רפואי מדי שנה בארצות הברית, עם כמעט 3,500 מקרי מוות 1,2,3,4,5,6. פגיעת כוויות מציבה אתגר גדול למערכת החיסונית של החולים ויוצרת פצע פתוח משמעותי, אשר נרפא לאט, ומותיר אותם רגישים להתיישבות עורית, ריאתית וסיסטמית עם חיידקים נוסוקומיאליים ואופורטוניסטיים. חוסר ויסות חיסוני בשילוב עם זיהום חיידקי קשור לעלייה בתחלואה ותמותה בקרב חולי כוויות7.

מודל של כוויות וזיהומים בבעלי חיים חיוני לחקר הפתוגנזה של זיהומים חיידקיים בעקבות נזק לעור ודיכוי חיסוני הקשור לטראומה מכוויות. מודלים כאלה מאפשרים תכנון והערכה של שיטות חדשות לטיפול בזיהומים חיידקיים בחולי כוויות. חולדות ובני אדם חולקים מאפייני עור, פיזיולוגיים ופתולוגיים דומים שתועדו בעבר8. בנוסף, החולדות קטנות יותר בגודלן, מה שהופך אותן לקלות יותר לטיפול, זולות יותר וקלות יותר לרכישה ולתחזוקה מאשר מודלים גדולים יותר של בעלי חיים.

מאפיינים אלה הופכים את החולדות לחיית מודל אידיאלית לחקר כוויות וזיהומים9. למרבה הצער, הטכניקה להשראת כוויות אינה עקבית ולעתים קרובות מתוארת באופן מינימלי 10,11,12,13,14. הפרוטוקול הנוכחי נועד לפתח הליך פשוט, חסכוני וניתן לשחזור ליצירת פגיעה עקבית בכוויות בעובי מלא במודל חולדה המדמה את התרחיש הקליני וניתן להשתמש בו להערכת דיכוי חיסוני וזיהום חיידקי.

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת צפון קרוליינה ונערכו בהתאם להנחיות שנקבעו שלה. זכרים ונקבות חולדות Sprague Dawley (250-300 גרם) בגילאי 7-9 שבועות שימשו לניסויים. כל בעלי החיים שוכנו במחזור אור-חושך של 12 שעות: 12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים אד ליביטו…

Representative Results

הפרוטוקול המוצג כאן ניתן לשחזור רב והביא לפציעת כוויה מדרגה שלישית בעובי מלא בחולדות. פצע הכוויה נראה לבן שעווה לאחר השראת הכוויה (איור 2B). צבע פציעת הכוויה השתנה מלבן לחום במהלך 72 שעות לאחר הכוויה (איור 2B-E). ניתוח היסטולוגי …

Discussion

מספר מודלים של כוויות הוצגו כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של פגיעה בכוויות 8,12,16,17. במחקר הנוכחי, השתמשנו במודל של חולדות כדי לפתח פרוטוקול פשוט וניתן לשחזור כדי לגרום לכוויה בעובי מלא ואחריה זיהום חיידקי כדי לדמות טראומה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים למחלקה לרפואה השוואתית באוניברסיטת צפון קרוליינה על מתן וטיפול בבעלי חיים. אנו מודים ללורן ראלף ולמיה אוונג’ליסטה בליבת שירותי הפתולוגיה על סיוע טכני מומחה בהיסטופתולוגיה/פתולוגיה דיגיטלית, כולל חתך רקמות והדמיה. מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר ממשרד ההגנה (פרס מספר W81XWH-20-1-0500, GR ו- TV).

Materials

1 mL syringe BD, USA 309597 Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube Olympus, USA 24-282 Used to carry morphine
10% NBF VWR, USA 16004-115 Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe BD, USA 302832 Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol Fischer Scientific, USA BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA n/a Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates BD, USA 285420 Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods n/a n/a Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators OMEGA Surgical supply, USA 4225-IMC Used to apply eye ointment
Electric shaver Oster, USA Golden A5 Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube Dechra, UK n/a The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads Medline, USA MSC281225 Used in the burn procedure
Forcep F.S.T. 11027-12 Used to hold the skin piece
Gauze sponges Oasis, USA PK412 Used to clean the applied nair cream from the dorsal side 
Heat-resistant gloves n/a n/a Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer IDEXX laboratories, USA ProCyte Dx
Induction chamber Kent Scientific, USA vetFlo-0730 Used to anesthesize the animals
Insulin syringe BD, USA 329461
Isoflurane Pivetal, USA NDC46066-755-04 Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser n/a n/a
Lactated ringer's solution icumedical, USA NDC0990-7953-09 Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader Fischer Scientific, USA 14-665-230
Mannitol Agar BD, USA 211407 Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA) greiner bio-one, USA 450480 Used to collect the blood
Morphine Mallinckrodt, UK NDC0406-8003-30 This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth BD, USA 275730
Muller Hinton II Agar BD, USA 211438
Nair hair removal lotion Nair, USA n/a Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G BD, USA 305193 Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline n/a n/a
Spectrophotometer ThermoScientific, USA Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female Charles River Labs n/a 7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor F.S.T. 14501-14 Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes Globe Scientific 220101236
Tissue Homogenizer Kinematica, Inc, USA POLYTRON PT2100 Used to homogenize the tissue samples
Water bath Fischer Scientific, USA n/a Used to induce the burn injury
Weighted heating pad Comfytemp, USA n/a Used during the procedure to keep rat's body warm

References

  1. Peck, M., Molnar, J., Swart, D. A global plan for burn prevention and care. Bulletin of the World Health Organization. 87, 802-803 (2009).
  2. American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2011 fact sheet. Chicago: American Burn Association. , (2011).
  3. Miller, S. F., et al. National burn repository 2007 report: a synopsis of the 2007 call for data. Journal of Burn Care & Research. 29 (6), 862-870 (2008).
  4. Kruger, E., Kowal, S., Bilir, S. P., Han, E., Foster, K. Relationship between patient characteristics and number of procedures as well as length of stay for patients surviving severe burn injuries: analysis of the American Burn Association National Burn Repository. Journal of Burn Care & Research. 41 (5), 1037-1044 (2020).
  5. American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2016. Burn Incidence Fact Sheet. Chicago: American Burn Association. , (2016).
  6. Willis, M. L., et al. Plasma extracellular vesicles released after severe burn injury modulate macrophage phenotype and function. Journal of Leukocyte Biology. 111 (1), 33-49 (2022).
  7. Kartchner, L. B., et al. One-hit wonder: late after burn injury, granulocytes can clear one bacterial infection but cannot control a subsequent infection. Burns. 45 (3), 627-640 (2019).
  8. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. Animal models in burn research. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  9. Cai, E. Z., et al. Creation of consistent burn wounds: a rat model. Archives of Plastic Surgery. 41 (4), 317 (2014).
  10. Pessolato, A. G. T., dos Santos Martins, D., Ambrósio, C. E., Mançanares, C. A. F., de Carvalho, A. F. Propolis and amnion reepithelialise second-degree burns in rats. Burns. 37 (7), 1192-1201 (2011).
  11. Gurung, S., Škalko-Basnet, N. Wound healing properties of Carica papaya latex: in vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology. 121 (2), 338-341 (2009).
  12. Eloy, R., Cornillac, A. Wound healing of burns in rats treated with a new amino acid copolymer membrane. Burns. 18 (5), 405-411 (1992).
  13. Upadhyay, N., et al. Safety and healing efficacy of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil on burn wounds in rats. Food and Chemical Toxicology. 47 (6), 1146-1153 (2009).
  14. El-Kased, R. F., Amer, R. I., Attia, D., Elmazar, M. M. Honey-based hydrogel: In vitro and comparative In vivo evaluation for burn wound healing. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
  15. Fan, G. -. Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
  16. Davenport, L., Dobson, G., Letson, H. A new model for standardising and treating thermal injury in the rat. MethodsX. 6, 2021-2027 (2019).
  17. Kaufman, T., Lusthaus, S., Sagher, U., Wexler, M. Deep partial skin thickness burns: a reproducible animal model to study burn wound healing. Burns. 16 (1), 13-16 (1990).
  18. Casal, D., et al. Blood supply to the integument of the abdomen of the rat: a surgical perspective. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (9), (2017).
  19. Casal, D., et al. A model of free tissue transfer: the rat epigastric free flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
  20. Naldaiz-Gastesi, N., Bahri, O. A., Lopez de Munain, A., McCullagh, K. J., Izeta, A. The panniculus carnosus muscle: an evolutionary enigma at the intersection of distinct research fields. Journal of Anatomy. 233 (3), 275-288 (2018).
  21. Weber, B., et al. Modeling trauma in rats: similarities to humans and potential pitfalls to consider. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 1-19 (2019).
  22. Nguyen, J. Q. M., et al. Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).
  23. Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes. Burns. 33 (5), 613-620 (2007).
  24. Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats. Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).
  25. Davies, J. W. . Physiological Responses to Burning Injury. , (1982).
  26. Neely, C. J., et al. Flagellin treatment prevents increased susceptibility to systemic bacterial infection after injury by inhibiting anti-inflammatory IL-10+ IL-12-neutrophil polarization. PloS One. 9 (1), e85623 (2014).
  27. Dunn, J. L., et al. Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).
  28. Gouma, E., et al. A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh’s constant in rats. Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).
  29. Dawson, N. The surface-area/body-weight relationship in mice. Australian Journal of Biological Sciences. 20 (3), 687-690 (1967).
  30. Moins-Teisserenc, H., et al. Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock. Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).
  31. Robins, E. V. Immunosuppression of the burned patient. Critical Care Nursing Clinics. 1 (4), 767-774 (1989).

Play Video

Cite This Article
Sharma, R., Yeshwante, S., Vallé, Q., Hussein, M., Thombare, V., McCann, S. M., Maile, R., Li, J., Velkov, T., Rao, G. Rat Burn Model to Study Full-Thickness Cutaneous Thermal Burn and Infection. J. Vis. Exp. (186), e64345, doi:10.3791/64345 (2022).

View Video