Summary
Un modelo que imite el escenario clínico de lesiones por quemaduras e infecciones es necesario para avanzar en la investigación de quemaduras. El presente protocolo demuestra un modelo simple y reproducible de infección por quemaduras de rata comparable al de los seres humanos. Esto facilita el estudio de quemaduras e infecciones después de quemaduras para desarrollar nuevos tratamientos antibióticos tópicos.
Abstract
Las metodologías de inducción de quemaduras se describen de manera inconsistente en modelos de ratas. Un modelo uniforme de herida por quemaduras, que representa el escenario clínico, es necesario para realizar investigaciones de quemaduras reproducibles. El presente protocolo describe un método simple y reproducible para crear ~ 20% de quemaduras de espesor total de superficie corporal (TBSA) en ratas. Aquí, se aplicó una varilla de cobre de 22,89cm2 (5,4 cm de diámetro) calentada a 97 °C en un baño de agua a la superficie de la piel de la rata para inducir la lesión por quemadura. Una varilla de cobre con una alta conductividad térmica fue capaz de disipar el calor más profundamente en el tejido de la piel para crear una quemadura de espesor total. El análisis histológico muestra epidermis atenuada con daño coagulativo en la extensión de espesor total de la dermis y el tejido subcutáneo. Además, este modelo es representativo de las situaciones clínicas observadas en pacientes hospitalizados con quemaduras después de una lesión por quemadura, como la desregulación inmune y las infecciones bacterianas. El modelo puede recapitular la infección bacteriana sistémica por bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. En conclusión, este artículo presenta un modelo de quemadura de rata robusto y fácil de aprender que imita las situaciones clínicas, incluida la desregulación inmune y las infecciones bacterianas, que es de considerable utilidad para el desarrollo de nuevos antibióticos tópicos para quemaduras e infecciones.
Introduction
Las lesiones por quemaduras se encuentran entre las formas más devastadoras de trauma, con tasas de mortalidad que alcanzan el 12% incluso en centros especializados en quemaduras 1,2,3. Según informes publicados recientemente, ~ 486,000 pacientes con quemaduras requieren atención médica anualmente en los Estados Unidos, con casi 3,500 muertes 1,2,3,4,5,6. La lesión por quemadura impone un gran desafío para el sistema inmunológico de los pacientes y crea una herida abierta significativa, que tarda en sanar, dejándolos susceptibles a la colonización cutánea, pulmonar y sistémica con bacterias nosocomiales y oportunistas. La desregulación inmune combinada con la infección bacteriana se asocia con mayor morbilidad y mortalidad en pacientes quemados7.
Un modelo de quemaduras e infecciones en animales es esencial para estudiar la patogénesis de las infecciones bacterianas después del daño de la piel y la supresión inmune asociada con el trauma por quemaduras. Tales modelos permiten el diseño y la evaluación de nuevos métodos para tratar infecciones bacterianas en pacientes con quemaduras. Las ratas y los humanos comparten características fisiológicas y patológicas similares a las de la piel que se han documentado previamente8. Además, las ratas son más pequeñas en tamaño, lo que las hace más fáciles de manejar, más asequibles y más fáciles de adquirir y mantener que los modelos animales más grandes.
Estas características hacen de las ratas un animal modelo ideal para estudiar quemaduras e infecciones9. Desafortunadamente, la técnica para la inducción de quemaduras es inconsistente y a menudo mínimamente descrita 10,11,12,13,14. El presente protocolo está diseñado para desarrollar un procedimiento simple, rentable y reproducible para crear una lesión por quemadura consistente de espesor total en un modelo de rata que simule el escenario clínico y pueda usarse para evaluar la supresión inmune y la infección bacteriana.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte y se llevaron a cabo de acuerdo con sus pautas establecidas. Para los experimentos se utilizaron ratas Sprague Dawley macho y hembra (250-300 g) de 7 a 9 semanas de edad. Todos los animales fueron alojados en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h:12 h con libre acceso a alimentos y agua ad libitum. Siempre trabaje con su veterinario institucional sobre un plan analgésico antes del inicio del estudio.
1. Preparación de ratas para la lesión por quemadura
- Preparar a los animales para lesiones por quemaduras 24 h antes de la quemadura.
- Anestesiar a la rata con isoflurano al 5% en oxígeno al 100% en una cámara de inducción durante 5 min (caudal: 2 L/min) hasta que la respiración haya disminuido.
- Una vez que la rata esté profundamente anestesiada (sin responder al pellizco del dedo del pie en todas las extremidades), mueva la rata a una almohadilla térmica en posición prona y reduzca el isoflurano al 1,5% en oxígeno para el mantenimiento a través de un cono nasal.
- Para evitar el secado de la córnea después de la anestesia y durante el procedimiento, aplique lubricante ocular en las córneas de ambos ojos con un aplicador con punta de algodón.
- Afeite el área dorsal de la rata con un cortapelos eléctrico (consulte la Tabla de materiales) y retire la mayor cantidad de pelo posible en un rectángulo grande desde los omóplatos hasta la base de la cola (Figura 2A).
- Limpie el área afeitada con un pañuelo empapado en solución salina para limpiar los pelos sueltos. Aplique loción depilatoria en el área afeitada con un aplicador con punta de algodón y déjelo actuar durante ~ 3 minutos.
NOTA: La aplicación de la loción depilatoria referenciada durante más de 3 minutos inducirá erupciones rojas en la piel. - Limpie el área con una esponja de gasa húmeda dos veces para quitar la loción y prevenir la irritación de la piel.
- Apague el isoflurano, retire el cono de la nariz y coloque a la rata en la jaula de recuperación.
NOTA: Coloque una almohadilla térmica en la jaula de recuperación. - Transfiera al animal recuperado a una jaula de alojamiento limpia para el procedimiento de quemadura del día siguiente (puede tomar ~ 10-15 minutos para que la rata se recupere de la anestesia).
2. Inducir la lesión por quemadura en ratas
- El día de la quema, ajuste la temperatura del baño de agua a 97 ° C y coloque las cuatro barras de cobre (420 g cada una; Figura 1) En el baño de agua 1 h antes del experimento de combustión para dejar que las varillas se calienten uniformemente.
NOTA: Las varillas deben sumergirse en el agua. Compruebe la precisión de la pantalla digital de temperatura con un termómetro antes del experimento. - Anestesiar a la rata como se menciona en la sección 1.
- Una vez que la rata no responda al pellizco del dedo del pie en todas las extremidades, colóquela en una almohadilla térmica en posición prona con isoflurano al 1,5% en oxígeno para el mantenimiento (Figura 2A).
- Inyectar morfina (20 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal (i.p.) para el tratamiento del dolor6.
- Compruebe la temperatura del agua en el baño de agua. Configure el temporizador y póngase los guantes resistentes al calor.
- Saque una varilla de cobre caliente del baño de agua y tóquela en el área del dorso de la rata durante 7 s para inducir la quemadura.
NOTA: Mantenga una distancia mínima (10-15 cm) entre el baño de agua y el animal para minimizar la pérdida de calor, y no ejerza presión sobre las varillas mientras induce la quemadura (es decir, el contacto debe mantenerse por gravedad). - Aplique cuatro quemaduras, usando una varilla por sitio de quemadura, una inmediatamente después de la otra para producir una quemadura de contacto completo de TBSA de aproximadamente 20% (Figura 2B).
- Después de la quemadura, resucitar al animal mediante inyección i.p. de solución de Ringer lactato (0,1 ml/g de peso corporal).
NOTA: Use una solución de timbre lactado ajustado a la temperatura corporal para resucitar a las ratas. - Apague el isoflurano, retire el cono de la nariz y coloque la rata en la estera de calor para su recuperación.
3. Preparación de inóculo bacteriano e infección
- Rayar la muestra congelada de Pseudomonas aeruginosa PAO1 y Staphylococcus aureus ATCC25923 en placas de agar Muller Hinton (MHA), 2 días antes del experimento de quemadura.
- Al día siguiente, seleccione una sola colonia de bacterias cultivadas de la placa y, usando un bucle de inoculación, raspe ligeramente la placa. Luego, colóquelo en el tubo de cultivo para inocular 10 ml de caldo Muller Hinton (MHB) y cultive durante la noche a 37 ° C en una coctelera de incubadora.
- El día de la quemadura y la infección, centrifugar el cultivo a 4.000 × g durante 5 min. Lave el pellet con solución salina normal (solución de NaCl al 0,9%).
- Resuspender el pellet bacteriano en solución salina y diluir hasta 0,1 OD 600nm (densidad óptica a600 nm). Diluir el inóculo bacteriano tomando 200 μL de esta suspensión bacteriana y mezclándolo con 800 μL de solución salina para obtener el inóculo bacteriano deseado de 2 × 107 UFC/ml.
- Inyectar 50 μL de P. aeruginosa o inóculo de S. aureupreparado en la etapa anterior (dosis de infección 1 × 106 UFC) en la rata anestesiada 15 min después de la quemadura, utilizando una aguja de 29 G por vía subcutánea lo más cerca posible de la herida de la quemadura.
- Después de infectar la herida de la quemadura, coloque la rata en la almohadilla térmica para su recuperación. Una vez que el animal se recupere (~ 15-20 min), alójelo en una jaula limpia.
NOTA: Después de la lesión por quemadura, aloje una rata por jaula. Use gránulos de comida húmeda con agua para facilitar la masticación y colóquelos en el piso de la jaula para facilitar el alcance. - Llene las botellas de agua en la jaula con agua con morfina (0.4 mg / ml) para controlar el dolor.
NOTA: La morfina oral refleja la situación clínica con pacientes con quemaduras humanas. Este estudio utilizó morfina oral para mantener estos experimentos comparables a los pacientes con quemaduras humanas después de consultar con el personal veterinario en numerosas ocasiones. Los registros de consumo de alcohol y peso se mantuvieron durante todo el experimento. Use el mismo sistema de bebida durante todos los procedimientos. Otros analgésicos, como la buprenorfina, se pueden administrar por vía subcutánea / intraperitoneal según las pautas institucionales de cuidado de los animales. - Complete la lista de verificación de monitoreo y monitoree a los animales de cerca para detectar angustia o enfermedad durante toda la duración del experimento.
4. Evaluación de la lesión por quemadura
- Evalúe la lesión por quemadura en la piel morfológicamente en términos de color y margen inmediatamente después de la lesión por quemadura.
- Manchar la piel quemada con hematoxilina y eosina (H&E) para visualizar la estructura de la herida por quemadura y el espacio epitelial15 (ver paso 5.6 para el procesamiento de la muestra).
5. Postprocesamiento de muestras de ratas y enumeración bacteriana
- Eutanasia a la rata a las 24, 48 y 72 h después de la quemadura con una sobredosis de anestesia.
- Extraiga muestras de sangre de las ratas mediante punción cardíaca y recójalas en un mini tubo de recolección.
- Analizar los recuentos sanguíneos completos de las muestras de sangre para determinar el efecto de la inducción de quemaduras en el sistema inmunitario del huésped.
- Cosechar piel, tejido subcutáneo, músculo, pulmón y bazo en el momento de la eutanasia.
NOTA: Mantenga una parte (~ 1 cm × 1 cm; pesando ~ 200-300 mg) de la piel para la tinción de H&E y otra parte para la enumeración bacteriana. - Recoja los tejidos en un tubo de recolección de 10 ml y colóquelos en solución salina normal sobre hielo para la enumeración bacteriana.
- Normalizar el peso del tejido con solución salina normal y homogeneizar las muestras utilizando un homogeneizador de tejidos (consulte la Tabla de materiales).
- Diluir en serie los homogeneizados del tejido en solución salina normal.
- Placa 100 μL de homogeneizado sin diluir y todas las diluciones de cada muestra de tejido en placas de agar cetrimida para muestras recogidas de ratas infectadas por P. aeruginosa.
NOTA: Use placas de agar manitol para colocar muestras recolectadas de ratas infectadas con S. aureus. - Incubar las placas a 37 °C en una incubadora durante 16-18 h.
- Al día siguiente, cuente las colonias bacterianas en las placas, multiplique por la relación de dilución para obtener el recuento de UFC / ml y normalice con el peso del tejido para calcular el tejido de UFC / g.
- Emplear software de análisis de datos para trazar los recuentos bacterianos en diferentes órganos en los diferentes puntos de tiempo de muestreo.
- Realice tinción H&E de la piel quemada para visualizar la estructura de la herida y la brecha epitelial.
- Usando tijeras y pinzas dentadas, corte un parche cutáneo de 1 cm x 1 cm del área de la quemadura y sumérjalo en un fijador (formalina tamponada neutra al 10%, NBF) durante 48 h a temperatura ambiente.
NOTA: Agite el recipiente para asegurarse de que todos los tejidos estén completamente sumergidos en el fijador, con el volumen del fijador 30 veces el volumen del tejido. - Deshidratar el tejido de la piel con etanol al 70% (v/v) durante 72 h a temperatura ambiente.
- Procesar las muestras deshidratadas en bloques de parafina para cortar las secciones y teñir con H&E15.
- Tome imágenes digitales de las diapositivas manchadas en un escáner de diapositivas (consulte la Tabla de materiales) utilizando un objetivo de 40x.
- Analice la imagen escaneada utilizando software (consulte el Archivo complementario 1 para el procesamiento de la imagen para el análisis; consulte la Tabla de materiales).
- Examine todos los campos de la sección de piel teñida para evaluar la condición de la epidermis, la dermis, el tejido subcutáneo y el músculo esquelético.
- Usando tijeras y pinzas dentadas, corte un parche cutáneo de 1 cm x 1 cm del área de la quemadura y sumérjalo en un fijador (formalina tamponada neutra al 10%, NBF) durante 48 h a temperatura ambiente.
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Representative Results
El protocolo presentado aquí es altamente reproducible y resultó en una lesión por quemadura de espesor total de tercer grado en ratas. La herida de la quemadura aparece de color blanco ceroso después de la inducción de la quemadura (Figura 2B). El color de la lesión por quemadura cambió de blanco a marrón en el transcurso de 72 h después de la quemadura (Figura 2B-E).
El análisis histológico confirmó una quemadura de espesor total (profundidad >2,61 mm a las 24 h después de la quemadura; Figura 3B). En comparación con la piel intacta sin quemaduras, las muestras de piel de animales quemados mostraron evidencia de lesión en todas las capas a las 24, 48 y 72 h después de la lesión por quemadura (Figura 3). Además, el análisis histológico mostró destrucción completa de la capa epidérmica y daño en todo el espesor de la dermis con afectación de la grasa subcutánea y el músculo esquelético (Figura 3B).
Para evaluar el aclaramiento bacteriano, se recolectaron varios tejidos a las 24, 48 y 72 h después de la infección con P. aeruginosa y S. aureus. Se recuperaron bacterias del sitio de infección para todas las ratas con lesiones por quemaduras (Figura 4A, B). Además, el número de bacterias recuperadas de la piel de ratas quemadas fue menor que el inóculo inicial para P. aeruginosa a las 24 h después de la infección, mientras que las muestras de tejido obtenidas a las 48 y 72 h después de la quemadura y la infección mostraron un aumento en la carga bacteriana (Figura 4A). En contraste, se observó un aumento de 2 log10 en todos los puntos temporales para S. aureus en la piel en comparación con el inóculo inicial (Figura 4B). Esto sugiere que S. aureus fue capaz de establecer la infección debido a su replicación activa en los tejidos y no sólo debido a la inmunosupresión inducida por la lesión por quemadura.
También se analizaron diferentes capas de la piel (es decir, tejido subcutáneo, músculos y órganos distales) para examinar la diseminación bacteriana. El tejido subcutáneo y los músculos mostraron una mayor carga bacteriana que el pulmón y el bazo. Tomados en conjunto, estos datos muestran que las ratas quemadas desarrollan una infección sistémica 24 h o 48 h después de la inoculación de la herida con P. aeruginosa (Figura 4A) o S. aureus, respectivamente (Figura 4B). También se obtuvieron recuentos sanguíneos completos utilizando un analizador de hematología (ver la Tabla de materiales) al inicio y 72 h después de la lesión por quemadura. Los recuentos totales de glóbulos blancos disminuyeron con el tiempo, lo que indica inmunosupresión. Los recuentos de neutrófilos disminuyeron después de la quemadura, pero aumentaron después de la infección a las 72 h en comparación con la línea de base (Tabla 1). Sin embargo, se observaron aumentos en los recuentos de glóbulos rojos y plaquetas después de la quemadura y la infección, lo que indica inflamación sistémica.
Figura 1: Varilla de cobre empleada para infligir inducción de quemaduras. El peso de la varilla hecha a medida es de 420 g con un diámetro de 5,4 cm y 6,4 cm de altura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Vista macroscópica del lado dorsal de la rata antes y después de la inducción de la quemadura. (A) Dorso de rata después del afeitado, (B) inmediatamente después de la lesión por quemadura, (C) 24 h después de la quemadura, (D) 48 h después de la quemadura y (E) 72 h después de la quemadura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de secciones transversales teñidas con H&E para cada nivel de gravedad de la quemadura. (A) La histología de la piel de rata simulada muestra una clara distinción entre la epidermis, la dermis y las capas de tejido subcutáneo. (B) La histología de la piel 24 h después de la quemadura muestra epidermis atenuada con daño coagulativo en todo el espesor de la dermis y el tejido subcutáneo con una profundidad máxima de quemadura de >2.61 mm. (C) A las 48 h después de la quemadura, la profundidad máxima de la quemadura fue de 2,35 mm, y (D) a las 72 h después de la quemadura, la profundidad máxima de la quemadura fue de 2,20 mm. Las imágenes se escanearon con un aumento de 40x. Barras de escala = 500 μm (A-D). Abreviatura: H&E = hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cuantificación de la carga bacteriana en diferentes órganos después de la infección de la herida por quemadura. Las ratas fueron infectadas con 6 log CFU de la bacteria a través de inyecciones subcutáneas 15 min después de la lesión por quemadura. La piel, el tejido subcutáneo, el músculo, el pulmón y el bazo se recolectaron a las 24, 48 y 72 h después de la infección para determinar la progresión de la enfermedad sistémica. Se utilizaron tres ratas en cada punto de tiempo. (A) Pseudomonas aeruginosa PA01, (B) Staphylococcus aureus ATCC25923. Abreviatura: CFU = unidades formadoras de colonias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tipo de célula | Línea de base (promedio ± DE) | 72 h No infectados (promedio ± DE) | 72 h-Infectado (promedio ± DE) |
| Glóbulos blancos (109/L) | 16,9 ± 4,9 | 7.1 ± 2.0 | 6,50 ± 5,5 |
| Neutrófilos (109/L); (%) | 4,0 ± 1,1; (24,3 ± 2,8) | 1,4 ± 0,4; (20,2 ± 5,7) | 1,88 ± 1,0; (35,0 ± 12,4) |
| Linfocitos (109/L); (%) | 11,6 ± 4,1; (68,5 ± 1,7) | 4,8 ± 1,7; (66,5 ± 7,6) | 3,54 ± 3,9; (46,4 ± 17,0) |
| Monocitos (109/L); (%) | 0,9 ± 0,3; (5,4 ± 1,5) | 0,8 ± 0,2; (11,5 ± 1,6) | 1,0 ± 0,6; (17,3 ± 5,5) |
| Glóbulos rojos (1012/L) | 7,5 ± 0,3 | 7.1 ± 0.8 | 10,0 ± 1,1 |
| Hemoglobina (g/dL) | 14,3 ± 0,7 | 13,4 ± 1,0 | 18,6 ± 2.0 |
| Plaquetas (109/L) | 723,3 ± 353,1 | 942,7 ± 43,1 | 1359,0 ± 228,5 |
| HCT (%) | 45,6 ± 3,0 | 39,9 ± 3,7 | 55,7 ± 8,2 |
Tabla 1: Parámetros hematológicos antes y después de la imposición de quemaduras e infección. Abreviatura: HCT = hematocrito.
Archivo complementario 1: Pasos para analizar imágenes H&E en Aperio ImageScope. Abreviatura: H&E = hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Se han presentado varios modelos de quemaduras para estudiar la fisiopatología de la lesión por quemadura 8,12,16,17. En el presente estudio, empleamos un modelo de rata para desarrollar un protocolo simple y reproducible para inducir una quemadura de espesor completo seguida de una infección bacteriana para simular un trauma por quemadura infectada en pacientes. La elección de la rata como modelo animal para imitar las condiciones humanas se basa en un equilibrio de costo, facilidad de uso, reproducibilidad y confiabilidad de los datos. El modelo de rata utilizado aquí tiene muchas ventajas sobre otros: es fácil de manejar y es el modelo de quemadura más utilizado, lo que permite comparaciones en toda la literatura. A pesar de que la rata es ampliamente utilizada en el entorno experimental, los tegumentos de rata y humanos no son histológicamente idénticos18,19. El tegumento de la rata está compuesto por la piel, una capa grasa conocida como panniculus adiposus, y debajo de esta capa hay una vaina de tejido conectivo suelto asociado con tejido adiposo blanco y músculo liso formando una capa conocida como panniculus carnosus. La última capa está ausente en la mayor parte del tegumento humano. Esto es importante, ya que sus células musculares lisas promueven una contracción rápida y amplia de la herida20. Además, debe tenerse en cuenta que los mecanismos de cicatrización de heridas de las ratas son sustancialmente diferentes de los de los humanos8. Por lo tanto, los investigadores deben tener esto en cuenta al interpretar los resultados del protocolo descrito en este documento. No obstante, la utilidad del modelo de rata para el estudio de las lesiones por quemaduras localizadas y la sepsis posquemadura es incuestionable y ha producido abundantes datos clínicamente confiables y transferibles21. Además, las ratas tienen más área de superficie en comparación con otros animales pequeños, lo que permite la inducción de heridas por quemaduras relativamente más grandes, lo que lo convierte en un buen modelo para estudios de quemaduras clínicamente relevantes.
Se han publicado diferentes métodos de inducción por quemaduras, incluyendo agua hirviendo16, barra de latón calentada 22, plantilla de aluminio calentada17, una placa caliente de temperatura constante colocada sobre varillas de acero inoxidable23 y escaldado sobre el 45% de la superficie corporal24. Un protocolo experimental ideal tendría la capacidad de lograr heridas por quemaduras que sean consistentes en tamaño y profundidad. En el presente estudio, se utilizaron barras de cobre de 420 g calentadas en agua a 97 ° C para transferir el calor a través de la conductancia directa para inducir la quemadura. Durante la inducción de quemaduras, las varillas se tocaron directamente con la superficie de la piel sin aplicar ninguna presión externa, ya que la conductancia de energía térmica de una estructura sólida a una superficie de la piel no depende de la presión empleada, sino del gradiente de temperatura 25 y la distancia entre la estructura sólida y la piel17,25. Los factores que determinaron la elección del metal incluyeron la conductividad térmica y la capacidad de resistir el óxido y la corrosión.
El cobre tiene una alta conductividad térmica (398 W / mK; donde W es calor en vatios, m es área en metros, K es temperatura en kelvin) en comparación con el acero inoxidable, aluminio o latón con 16 W / mK, 225 W / mK y 109 W / mK, respectivamente9. Las varillas metálicas de alta conductividad térmica disiparían la energía térmica más rápido en los tejidos de la piel que las varillas de baja conductividad térmica e inducirían un nivel más profundo de quemaduras dentro de la misma duración de exposición. Además, el tamaño y el peso de la varilla se escalaron alométricamente del modelo de quemadura en ratones 7,26,27 e induce una quemadura de TBSA de aproximadamente el 20%. Una varilla de 1,9 cm de diámetro (el área total de quemadura es de 11,3 cm 2 en un ratón después de cuatro aplicaciones) se escaló a 5,4 cm de diámetro (el área total de quemadura es de 91,6 cm 2 en una rata después de cuatro aplicaciones) para inducir una quemadura similar de ~ 20% -30% TBSA en rata (TBSA de una rata de 220 g es 356,0 cm2)28, considerando que el TBSA de rata es 6 veces más grande que el ratón (TBSA de un ratón de 20 g es 61,2 cm2)29. Los resultados demuestran claramente que este método indujo quemaduras de espesor total, y el análisis histológico indicó un excelente contraste entre los tejidos de la piel normales y quemados en diferentes puntos de tiempo después de la quemadura (Figura 3). Este modelo también fue capaz de capturar la inmunosupresión, que se observa en pacientes después de la lesión por quemadura30,31 (Tabla 1).
Las infecciones bacterianas son una amenaza importante que compromete el proceso de curación de los pacientes con quemaduras y, a menudo, son la principal causa de morbilidad y mortalidad después de las lesiones por quemaduras. Para simular condiciones similares, la rata se infectó después de una lesión por quemadura con P. aeruginosa o S. aureus. Inicialmente, intentamos la aplicación tópica de las bacterias, pero la apariencia cerosa de la superficie de la quemadura inhibió la absorción del inóculo bacteriano. Este modelo también fue capaz de recapitular la progresión sistémica de la enfermedad después de la infección bacteriana del sitio de la quemadura como se ve con la carga bacteriana recuperada del pulmón y el bazo (Figura 4). En conclusión, hemos demostrado un método simple y reproducible para crear quemaduras de espesor total que exhiben muchas de las características observadas en las lesiones por quemaduras humanas. Este protocolo puede ayudar a estudiar una amplia variedad de nuevas terapias tópicas para el tratamiento de quemaduras infectadas. Este modelo también se puede utilizar como un modelo rentable para evaluar diferentes apósitos para heridas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la División de Medicina Comparada de la Universidad de Carolina del Norte por la provisión y el cuidado de los animales. Agradecemos a Lauren Ralph y Mia Evangelista en el Núcleo de Servicios de Patología por la asistencia técnica experta con Histopatología / Patología Digital, incluida la sección de tejidos y las imágenes. Esta investigación fue apoyada por una beca de investigación del Departamento de Defensa (número de premio W81XWH-20-1-0500, GR y TV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
References
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