Modelo de queimadura de rato para estudar queimadura térmica cutânea de espessura total e infecção

Summary

Um modelo que imite o cenário clínico de lesão por queimadura e infecção é necessário para promover a pesquisa de queimaduras. O presente protocolo demonstra um modelo de infecção por queimadura de rato simples e reprodutível, comparável ao de humanos. Isso facilita o estudo de queimaduras e infecções após a queimadura para o desenvolvimento de novos tratamentos tópicos com antibióticos.

Abstract

As metodologias de indução de queimaduras são descritas de forma inconsistente em modelos de ratos. Um modelo uniforme de queimadura, que represente o cenário clínico, é necessário para a realização de pesquisas de queimaduras reprodutíveis. O presente protocolo descreve um método simples e reprodutível para criar queimaduras de espessura total de ~20% da área total do corpo (TBSA) em ratos. Aqui, uma haste de cobre^{de 22,89 cm 2} (5,4 cm de diâmetro) aquecida a 97 °C em banho-maria foi aplicada na superfície da pele do rato para induzir a lesão por queimadura. Uma haste de cobre com uma alta condutividade térmica foi capaz de dissipar o calor mais profundamente no tecido da pele para criar uma queimadura de espessura total. A análise histológica mostra epiderme atenuada com dano coagulativo na extensão de toda a espessura da derme e do tecido subcutâneo. Além disso, esse modelo é representativo das situações clínicas observadas em pacientes queimados hospitalizados após lesão por queimadura, como desregulação imunológica e infecções bacterianas. O modelo pode recapitular a infecção bacteriana sistêmica por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Em conclusão, este artigo apresenta um modelo de queimadura de rato robusto e de fácil aprendizado que imita as situações clínicas, incluindo desregulação imunológica e infecções bacterianas, o que é de considerável utilidade para o desenvolvimento de novos antibióticos tópicos para queimaduras e infecções.

Introduction

As queimaduras estão entre as formas mais devastadoras de trauma, com taxas de mortalidade chegando a 12%, mesmo em centros especializados em queimados ^1,2,3. De acordo com relatórios publicados recentemente, ~ 486.000 pacientes queimados requerem cuidados médicos anualmente nos Estados Unidos, com quase 3.500 mortes 1,2,3,4,5,6. A lesão por queimadura impõe um grande desafio para o sistema imunológico dos pacientes e cria uma ferida aberta significativa, que é lenta para cicatrizar, deixando-os suscetíveis à colonização cutânea, pulmonar e sistêmica com bactérias nosocomiais e oportunistas. A desregulação imunológica combinada com a infecção bacteriana está associada ao aumento da morbidade e mortalidade em pacientes queimados⁷.

Um modelo de queimadura e infecção animal é essencial para estudar a patogênese de infecções bacterianas após danos à pele e imunossupressão associados ao trauma de queimadura. Tais modelos permitem o desenho e avaliação de novos métodos para o tratamento de infecções bacterianas em pacientes queimados. Ratos e humanos compartilham características fisiológicas e patológicas da pele semelhantes que foram previamente documentadas⁸. Além disso, os ratos são menores em tamanho, tornando-os mais fáceis de manusear, mais acessíveis e mais fáceis de adquirir e manter do que os modelos animais maiores.

Essas características fazem dos ratos um animal modelo ideal para o estudo de queimaduras e infecções⁹. Infelizmente, a técnica de indução de queimaduras é inconsistente e, muitas vezes, minimamente descrita 10,11,12,13,14. O presente protocolo foi projetado para desenvolver um procedimento simples, econômico e reprodutível para criar uma lesão por queimadura consistente de espessura total em um modelo de rato que simula o cenário clínico e pode ser usado para avaliar a imunossupressão e a infecção bacteriana.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte e foram conduzidos de acordo com suas diretrizes estabelecidas. Ratos Sprague Dawley machos e fêmeas (250-300 g) com idades entre 7-9 semanas de idade foram utilizados para os experimentos. Todos os animais foram alojados em um ciclo claro-escuro de 12 h:12 h, com livre acesso a alimentos e água ad libitum. Sempre trabalhe com seu veterinário institucional sobre um plano …

Representative Results

O protocolo aqui apresentado é altamente reprodutível e resultou em uma lesão por queimadura de terceiro grau, de espessura total, em ratos. A ferida da queimadura aparece branca cerosa após a indução da queimadura (Figura 2B). A cor da lesão por queimadura mudou de branca para marrom ao longo de 72 h pós-queimadura (Figura 2B-E). A análise histológica confirmou queimadura de espessura total…

Discussion

Vários modelos de queimaduras têm sido apresentados para estudar a fisiopatologia da lesão por queimadura 8,12,16,17. No presente estudo, empregamos um modelo de rato para desenvolver um protocolo simples e reprodutível para induzir uma queimadura de espessura total seguida de infecção bacteriana para simular um trauma de queimadura infectado em pacientes. A escolha do rato como modelo an…

Materials

1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm