全層皮膚熱傷と感染を研究するためのラット火傷モデル
1UNC Eshelman School of Pharmacy,University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry & Pharmacology, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences,The University of Melbourne, 3Department of Microbiology & Immunology,University of North Carolina School of Medicine, 4Department of Surgery,University of North Carolina at Chapel Hill, 5Curriculum in Toxicology and Environmental Medicine,University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Microbiology, Monash Biomedicine Discovery Institute,Monash University
Summary
熱傷と感染症の臨床シナリオを模倣したモデルは、熱傷研究を促進するために必要です。本プロトコルは、ヒトにおけるそれに匹敵する単純で再現可能なラット熱傷感染モデルを実証する。これにより、新しい局所抗生物質治療を開発するための火傷および火傷後の感染症の研究が容易になります。
Abstract
熱傷誘発の方法論は、ラットモデルでは一貫して説明されていません。再現可能な熱傷研究を行うには、臨床シナリオを表す均一な熱傷モデルが必要です。本プロトコルは、ラットにおいて~20%の全体表面積(TBSA)全層熱傷を生じさせるための簡単で再現性のある方法を記載している。ここでは、水浴中で97°Cで加熱した22.89cm2(直径5.4cm)の銅棒をラット皮膚表面に塗布し、熱傷を誘発した。熱伝導率の高い銅棒は、皮膚組織の奥深くに熱を放散して、全層の火傷を引き起こすことができました。組織学的分析は、真皮および皮下組織の全層範囲への凝固損傷を伴う表皮の減弱を示す。さらに、このモデルは、免疫調節不全や細菌感染などの火傷後の入院熱傷患者で観察される臨床状況の代表です。このモデルは、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方による全身性細菌感染を再現できます。結論として、この論文は、免疫調節不全や細菌感染などの臨床状況を模倣した、習得が容易で堅牢なラット熱傷モデルを提示し、熱傷や感染症に対する新しい局所抗生物質薬の開発にかなりの有用性があります。
Introduction
火傷は最も壊滅的な形態の外傷の1つであり、専門の火傷センターでも死亡率は12%に達します1,2,3。最近発表された報告によると、米国では毎年~486,000人の熱傷患者が医療を必要としており、3,500人近くが死亡しています1,2,3,4,5,6。火傷は患者の免疫系に大きな課題を課し、治癒が遅い重大な開放創を作り出し、院内および日和見細菌による皮膚、肺、および全身のコロニー形成の影響を受けやすくなります。細菌感染と組み合わされた免疫調節不全は、火傷患者の罹患率と死亡率の増加に関連しています7。
動物の熱傷および感染モデルは、皮膚の損傷および熱傷外傷に関連する免疫抑制後の細菌感染の病因を研究するために不可欠です。このようなモデルは、熱傷患者の細菌感染症を治療するための新しい方法の設計と評価を可能にします。ラットとヒトは、以前に文書化されている同様の皮膚の生理学的および病理学的特徴を共有しています8。さらに、ラットはサイズが小さいため、大型の動物モデルよりも取り扱いが容易で、手頃な価格で、調達と保守が容易です。
これらの特性により、ラットは火傷や感染症を研究するのに理想的なモデル動物になります9。残念ながら、火傷誘発の技術は一貫性がなく、しばしば最小限に記述されています10、11、12、13、14。本プロトコルは、臨床シナリオをシミュレートし、免疫抑制および細菌感染を評価するために使用できるラットモデルで一貫した全層熱傷を作成するための簡単で費用効果が高く、再現可能な手順を開発するように設計されています。
Protocol
すべての手順は、ノースカロライナ大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認され、確立されたガイドラインに従って実施されました。7〜9週齢の雄および雌のSprague Dawleyラット(250〜300g)を実験に使用した。すべての動物は、12時間:12時間の明暗サイクルで飼育され、食物と水が 自由に自由にアクセスできました。研究を開始する前に、鎮痛計画について必ず施設の獣医師と?…
Representative Results
ここに提示されたプロトコルは非常に再現性が高く、ラットに3度の全層熱傷をもたらしました。火傷の傷は、火傷誘発後にワックス状の白色に見えます(図2B)。火傷の色は、火傷後72時間の間に白から茶色に変化しました(図2B-E)。 組織学的分析により、全層熱傷(熱傷後24時間の深さ>2.61 mm; <strong class="xf…
Discussion
熱傷の病態生理学を研究するために、いくつかの熱傷モデルが提示されている8、12、16、17。本研究では、ラットモデルを使用して、患者の感染した熱傷をシミュレートするために、全層熱傷とそれに続く細菌感染を誘発するためのシンプルで再現性のあるプロトコルを開発しました。人間の状態…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、動物の提供と世話についてノースカロライナ大学の比較医学部門に感謝しています。病理サービスコアのローレンラルフとミアエヴァンジェリスタには、組織切片やイメージングを含む組織病理学/デジタルパソロジーに関する専門的な技術支援に感謝します。この研究は、国防総省(賞番号W81XWH-20-1-0500、GRおよびTV)からの研究助成金によって支援されました。
Materials
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
References
- Peck, M., Molnar, J., Swart, D. A global plan for burn prevention and care. Bulletin of the World Health Organization. 87, 802-803 (2009).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2011 fact sheet. Chicago: American Burn Association. , (2011).
- Miller, S. F., et al. National burn repository 2007 report: a synopsis of the 2007 call for data. Journal of Burn Care & Research. 29 (6), 862-870 (2008).
- Kruger, E., Kowal, S., Bilir, S. P., Han, E., Foster, K. Relationship between patient characteristics and number of procedures as well as length of stay for patients surviving severe burn injuries: analysis of the American Burn Association National Burn Repository. Journal of Burn Care & Research. 41 (5), 1037-1044 (2020).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2016. Burn Incidence Fact Sheet. Chicago: American Burn Association. , (2016).
- Willis, M. L., et al. Plasma extracellular vesicles released after severe burn injury modulate macrophage phenotype and function. Journal of Leukocyte Biology. 111 (1), 33-49 (2022).
- Kartchner, L. B., et al. One-hit wonder: late after burn injury, granulocytes can clear one bacterial infection but cannot control a subsequent infection. Burns. 45 (3), 627-640 (2019).
- Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. Animal models in burn research. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3241-3255 (2014).
- Cai, E. Z., et al. Creation of consistent burn wounds: a rat model. Archives of Plastic Surgery. 41 (4), 317 (2014).
- Pessolato, A. G. T., dos Santos Martins, D., Ambrósio, C. E., Mançanares, C. A. F., de Carvalho, A. F. Propolis and amnion reepithelialise second-degree burns in rats. Burns. 37 (7), 1192-1201 (2011).
- Gurung, S., Škalko-Basnet, N. Wound healing properties of Carica papaya latex: in vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology. 121 (2), 338-341 (2009).
- Eloy, R., Cornillac, A. Wound healing of burns in rats treated with a new amino acid copolymer membrane. Burns. 18 (5), 405-411 (1992).
- Upadhyay, N., et al. Safety and healing efficacy of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil on burn wounds in rats. Food and Chemical Toxicology. 47 (6), 1146-1153 (2009).
- El-Kased, R. F., Amer, R. I., Attia, D., Elmazar, M. M. Honey-based hydrogel: In vitro and comparative In vivo evaluation for burn wound healing. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Fan, G. -. Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
- Davenport, L., Dobson, G., Letson, H. A new model for standardising and treating thermal injury in the rat. MethodsX. 6, 2021-2027 (2019).
- Kaufman, T., Lusthaus, S., Sagher, U., Wexler, M. Deep partial skin thickness burns: a reproducible animal model to study burn wound healing. Burns. 16 (1), 13-16 (1990).
- Casal, D., et al. Blood supply to the integument of the abdomen of the rat: a surgical perspective. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (9), (2017).
- Casal, D., et al. A model of free tissue transfer: the rat epigastric free flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
- Naldaiz-Gastesi, N., Bahri, O. A., Lopez de Munain, A., McCullagh, K. J., Izeta, A. The panniculus carnosus muscle: an evolutionary enigma at the intersection of distinct research fields. Journal of Anatomy. 233 (3), 275-288 (2018).
- Weber, B., et al. Modeling trauma in rats: similarities to humans and potential pitfalls to consider. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 1-19 (2019).
- Nguyen, J. Q. M., et al. Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).
- Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes. Burns. 33 (5), 613-620 (2007).
- Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats. Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).
- Davies, J. W. . Physiological Responses to Burning Injury. , (1982).
- Neely, C. J., et al. Flagellin treatment prevents increased susceptibility to systemic bacterial infection after injury by inhibiting anti-inflammatory IL-10+ IL-12-neutrophil polarization. PloS One. 9 (1), e85623 (2014).
- Dunn, J. L., et al. Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).
- Gouma, E., et al. A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh’s constant in rats. Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).
- Dawson, N. The surface-area/body-weight relationship in mice. Australian Journal of Biological Sciences. 20 (3), 687-690 (1967).
- Moins-Teisserenc, H., et al. Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock. Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).
- Robins, E. V. Immunosuppression of the burned patient. Critical Care Nursing Clinics. 1 (4), 767-774 (1989).
Cite This Article
Sharma, R., Yeshwante, S., Vallé, Q., Hussein, M., Thombare, V., McCann, S. M., Maile, R., Li, J., Velkov, T., Rao, G. Rat Burn Model to Study Full-Thickness Cutaneous Thermal Burn and Infection. J. Vis. Exp. (186), e64345, doi:10.3791/64345 (2022).