トマトの種子発育の研究のための効率的な清算プロトコル(Solanum lycopersicum L.)

Summary

トマトの種子は、植物の繁殖中の遺伝学と発生生物学を研究するための重要なモデルです。このプロトコルは、さまざまな発生段階でトマトの種子をきれいにして、より細かい胚構造を観察するのに役立ちます。

Abstract

トマト(Solanum lycopersicum L.)は、世界中の主要な換金作物の1つです。トマトの種子は、植物の繁殖中の遺伝学と発生生物学を研究するための重要なモデルです。トマト種子内のより微細な胚構造の可視化は、種皮粘液、多細胞層外皮、および厚肉胚乳によって妨げられることが多く、これは面倒な埋め込み切片によって解決する必要があります。より簡単な代替案は、化学薬品を使用して種子をほぼ透明にする組織透明化技術を採用することです。従来のクリアリング手順では、より薄い種皮で小さな種子を深く洞察することができますが、トマトの種子のクリアは、特に発育後期段階では、技術的に引き続き困難です。

ここに提示されているのは、胚の形態がほぼ完了する開花後3日から23日までのトマト種子の発達を観察するための迅速で省力化のクリアリングプロトコルです。この方法は、 シロイヌナ ズナで広く用いられている抱水クロラール系清澄液に、ホルマリン-アセト-アルコール(FAA)固定の省略、種子の次亜塩素酸ナトリウム処理の添加、軟化した種皮粘液の除去、洗浄・減圧処理などの改良を加えたものです。この方法は、さまざまな発生段階でトマト種子を効率的に除去するために適用でき、良好な空間分解能で変異種子の発生過程を完全に監視するのに役立ちます。このクリアリングプロトコルは、ナス科の他の商業的に重要な種のディープイメージングにも適用できます。

Introduction

トマト(S. lycopersicum L.)は、世界で最も重要な野菜作物の1つであり、2020年には510万ヘクタールから1億8,680万トンの肉質の果物が生産されています¹。ナス、ピーマン、ジャガイモ、タバコなどの多くの商業的に重要な作物を含む、約2,716種²の大きなナス科に属しています。栽培トマトは二倍体種(2n = 2x = 24)で、ゲノムサイズは約900 Mb³です。長い間、野生のナス属から望ましい形質を選択することにより、トマトの家畜化と育種に多大な努力が払われてきました。トマト遺伝学リソースセンターには5,000を超えるトマトのアクセッションがリストされており、世界中で80,000を超えるトマトの生殖質が保管されています⁴。トマト植物は温室内で多年生であり、種子によって繁殖します。成熟したトマト種子は、完全に成長した胚、残留細胞型胚乳、および硬い種皮の3つの主要な区画で構成されています^5,6(図1A)。二重受精後、細胞型胚乳の発生は接合子の発生に先行する。開花後~5~6日(DAF)に、胚乳が6〜8個の核⁷からなるときに2細胞前胚が最初に観察される。Solanum pimpinellifoliumでは、胚は20 DAF後に最終サイズに近づき、種子は32 DAF⁸の後に発芽するために生存可能です。胚が成長するにつれて、胚乳は徐々に吸収され、少量の胚乳だけが種子に残ります。残留胚乳は、幼根先端を囲む小毛洞胚乳と^{、種子の残りの部分}の外側胚乳^9,10からなる。外側の種皮は、外皮の肥厚して木化した外側表皮から発達し、外皮の残骸の死んだ層とともに、胚と胚乳を保護するために硬い殻を形成します⁵。

図1:ソラナム・リコペルシカムとシロイヌナズナの成熟種子の模式図。 (A)成熟トマト種子の縦断的解剖学的構造。(B)成熟したシロイヌナズナ種子の縦断的解剖学的構造。成熟したトマトの種子は、シロイヌナズナの種子の約70倍の大きさです。スケールバー = (A) 400 μm、(B) 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

高品質のトマト種子の生産は、胚、胚乳、および母体の種子成分間の調整に依存します¹¹。種子発生における重要な遺伝子とネットワークを解剖するには、変異種子の深くフルトラックの表現型記録が必要です。半薄切片やパラフィン切片などの従来の包埋切片技術は、胚の局所的で微細な構造を観察するためにトマト種子に広く適用されています¹²、^13、14、15。ただし、薄い切片からシードの発達を分析することは通常面倒であり、z軸の空間分解能が不足しています。それに比べて、組織クリアリングは、発生する可能性が最も高い胚の欠陥の発生段階を特定するための迅速かつ効率的な方法です¹⁶。透明化方法は、1つ以上の生化学物質¹⁶で屈折率を均質化することによって内部組織の不透明さを低減する。全組織クリアリングは、その完全性を損なうことなく植物組織構造の観察を可能にし、クリアリング技術と3次元イメージングの組み合わせは、植物器官の形態および発生状態に関する情報を得るための理想的なソリューションとなっている^17,18。長年にわたり、種子除去技術は、シロイヌナズナ、尋常性ホルデウム、および尋常性ベータ19,20,21,22,23を含む様々な植物種で使用されてきた。これらのうち、ホールマウント胚珠除去技術は、サイズが小さく、種皮細胞の4〜5層、および核型胚乳^24,25のために、シロイヌナズナの種子発達を研究するための効率的なアプローチでした。Hoyerの溶液²⁶の出現など、さまざまな透明混合物の継続的な更新により、大麦胚珠の内部構造は、その胚乳が種子の大部分を占めているにもかかわらず、高度な明瞭さで画像化されました。テンサイの胚形成は、減圧処理と塩酸¹⁹を組み合わせた透明化によって観察できます。それにもかかわらず、上記の種とは異なり、トマト種子のプロトコルをクリアすることによる発生学的観察は報告されていません。これにより、トマトの胚発生と種子発生の詳細な調査が妨げられます。

抱水クロラールは、浸漬された組織および細胞を異なる光学面上に表示させることを可能にし、細胞または組織成分を実質的に保存する透明化溶液として一般的に使用される^27、28、29。抱水クロラールベースのクリアリングプロトコルは、シロイヌナズナの胚と胚乳を観察するための種子のホールマウントクリアリングに使用されています^21,28。しかし、この清澄化液は、シロイヌナズナの種子よりも不浸透性であるトマトの種子の除去には効率的ではありません。物理的障壁には、(1)トマトの外皮は3〜15 DAF 30,31で約20の細胞層を有する、(2)トマトの胚乳は核型ではなく細胞型^である32、(3)トマト種子のサイズは約70倍大きい^33,34、(4)大量の種皮粘液を生成し、透明化試薬の浸透をブロックし、胚細胞の可視化に影響を与える。

そこで本報告では、トマト種子をさまざまな段階で全マウントで除去するための最適化された抱水クロラールベースの透明化方法を提示し、胚発生過程の深部イメージングを可能にします(図2)。

Protocol

1.溶液の調製 50 mLの遠沈管に2.5 mLの37%ホルムアルデヒド、2.5 mLの氷酢酸、および45 mLの70%エタノールを加えて、FAA固定液を調製します。ボルテックスし、4°Cで保存します。 使用直前にFAA固定液を新たに調製してください。注意: 37%ホルムアルデヒドは腐食性であり、暴露または吸入すると発がん性がある可能性があります。固定剤は、適切な個人用保護具を着用しなが?…

Representative Results

シロイヌナズナのように従来の方法でトマトの種子を駆除すると、密な胚乳細胞が3DAFと6DAFで初期トマト胚の可視化を妨げました(図3A、B)。胚の総体積が増加するにつれて、球状胚は9DAFでほとんど区別できませんでした(図3C)。しかし、種子のサイズが大きくなり続けるにつれて、その透過性は減少し、12 DAFでぼやけた心臓胚が?…

Discussion

機械的切片化と比較して、透明化技術は、植物組織または器官の完全性を保持するので、三次元イメージングにとってより有利である¹⁶。従来の清澄処理プロトコルは、化学溶液の浸透が容易であるため、小さなサンプルに限定されることがよくあります。トマト種子は、シロイヌナズナの種子の約70倍の大きさで、透過性障壁が高いため、組織透明化に問題のあるサ…

Materials

1,000 µL pipette	GILSON	FA10006M
1,000 µL pipette tips	Corning	T-1000-B
2 ml centrifuge tube	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehyde	DAMAO	685-2013
5,000 µL pipette	Eppendorf	3120000275
5,000 µL pipette tips	biosharp	BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bottle glass	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscope	Zeiss	Axio Imager A1	10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Flower nutrient soil	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Glacial Acetic Acid	BOYUAN	676-2007
Glycerol	Solarbio	G8190
Magnetic stirrer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbital shaker	QILINBEIER	QB-206
Seeding substrate	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Screening:0-10 mm
Single concave slide	HUABODEYI	HBDY1895
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscope	Leica	S8 APO	1x to 4x magnification
Tin foil	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vacuum pump	SHIDING	SHB-III
Vortex meter	Silogex	MX-S