Эффективный клиринговый протокол для изучения развития семян в томатах (Solanum lycopersicum L.)

Summary

Семена томатов являются важной моделью для изучения генетики и биологии развития во время размножения растений. Этот протокол полезен для очистки семян томатов на разных стадиях развития, чтобы наблюдать более тонкую эмбриональную структуру.

Abstract

Помидор (Solanum lycopersicum L.) является одной из основных товарных культур во всем мире. Семена томатов являются важной моделью для изучения генетики и биологии развития во время размножения растений. Визуализация более тонкой эмбриональной структуры внутри семени томата часто затруднена слизистой оболочкой семян, многоклеточным слоистым покровом и толстостенным эндоспермом, который необходимо устранить трудоемким встраиванием-сечением. Более простой альтернативой является использование методов очистки тканей, которые делают семена почти прозрачными с помощью химических агентов. Хотя обычные процедуры очистки позволяют глубоко проникнуть в более мелкие семена с более тонкой семенной оболочкой, очистка семян томатов по-прежнему является технически сложной задачей, особенно на поздних стадиях развития.

Здесь представлен быстрый и трудосберегающий протокол очистки для наблюдения за развитием семян томатов от 3 до 23 дней после цветения, когда эмбриональная морфология почти завершена. Этот метод сочетает в себе раствор очистки на основе хлоралгидрата, широко используемый в Арабидопсисе , с другими модификациями, включая пропуск фиксации формалин-ацето-спирта (FAA), добавление обработки семян гипохлоритом натрия, удаление размягченной слизи семенной оболочки, а также промывку и вакуумную обработку. Этот метод может быть применен для эффективной очистки семян томатов на разных стадиях развития и полезен при полном мониторинге процесса развития мутантных семян с хорошим пространственным разрешением. Этот протокол очистки может также применяться для глубокой визуализации других коммерчески важных видов в Solanaceae.

Introduction

Томат (S. lycopersicum L.) является одной из важнейших овощных культур во всем мире, с объемом производства 186,8 млн. тонн мясистых фруктов с 5,1 млн. га в 2020 году¹. Он принадлежит к большому семейству пасленовых, насчитывающему около 2 716 видов², включая многие коммерчески важные культуры, такие как баклажаны, перец, картофель и табак. Культивируемый помидор является диплоидным видом (2n = 2x = 24) с размером генома около 900 Mb³. В течение долгого времени были приложены большие усилия для одомашнивания и селекции томатов путем отбора желаемых признаков из дикого Solanum spp. В Центре генетических ресурсов томатов зарегистрировано более 5000 томатов, и во всем мире хранится более 80 000 зародышевой плазмы помидоров⁴. Растение томат является многолетним в теплице и размножается семенами. Зрелое семя томата состоит из трех основных отсеков: полноценного эмбриона, остаточного эндосперма клеточного типа и твердой семенной оболочки ^5,6 (рисунок 1А). После двойного оплодотворения развитию эндосперма клеточного типа предшествует развитие зигот. Через ~5-6 дней после цветения (DAF) впервые наблюдается двухклеточное проэмбрио, когда эндосперм состоит из шести-восьми ядер⁷. В Solanum pimpinellifolium эмбрион приближается к своему окончательному размеру после 20 DAF, а семена жизнеспособны для прорастания после 32 DAF⁸. По мере развития эмбриона эндосперм постепенно всасывается и в семени остается лишь небольшое количество эндосперма. Остаточный эндосперм состоит из микропирлярного эндосперма, окружающего кончик радика, и бокового эндосперма в остальной части семени ^9,10. Наружная семенная оболочка развивается из утолщенного и одревесного наружного эпидермиса покрова, а с отмершими слоями остатков покрова они образуют твердую оболочку для защиты эмбриона и эндосперма⁵.

Рисунок 1: Схематическое изображение зрелого семени у Solanum lycopersicum и Arabidopsis thaliana. (A) Продольная анатомия зрелого семени томата. (B) Продольная анатомия зрелого семени Arabidopsis . Зрелое семя помидора примерно в 70 раз больше по размеру, чем семя арабидопсиса . Шкала = (A) 400 мкм, (B) 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Производство высококачественных семян томатов зависит от координации между компонентами эмбриона, эндосперма и материнского семенного компонента¹¹. Препарирование ключевых генов и сетей в развитии семян требует глубокой и полной фенотипической регистрации мутантных семян. Традиционные методы встраивания-сечения, такие как полутонкое сечение и парафиновое сечение, широко применяются к семенам томатов для наблюдения за местными и более тонкими структурами эмбриона ^12,13,14,15. Однако анализ развития семян из тонких участков обычно трудоемкий и не имеет пространственного разрешения по оси Z. Для сравнения, очистка тканей является быстрым и эффективным методом для точного определения стадии развития дефектов эмбриона, которые, скорее всего, произойдут¹⁶. Способ очистки уменьшает непрозрачность внутренней ткани путем гомогенизации показателя преломления одним или несколькими биохимическими агентами¹⁶. Очистка всей ткани позволяет наблюдать структуру растительной ткани, не разрушая ее целостность, а сочетание технологии очистки и трехмерной визуализации стало идеальным решением для получения информации о морфологии и состоянии развития растительного органа^17,18. На протяжении многих лет методы очистки семян использовались у различных видов растений, включая Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare и Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Среди них технология очистки яйцеклеток с цельной горой была эффективным подходом к изучению развития семян Arabidopsis, благодаря его небольшому размеру, 4-5 слоям клетки семенной оболочки и эндосперму ядерного типа^24,25. При постоянном обновлении различных очищающих смесей, таких как появление раствора^{Хойера 26}, внутренние структуры яйцеклетки ячменя были изображены с высокой степенью прозрачности, хотя ее эндосперм составляет основную часть семян. Эмбриогенез сахарной свеклы можно наблюдать путем очистки в сочетании с вакуумной обработкой и размягчения соляной кислотой¹⁹. Тем не менее, в отличие от видов, упомянутых выше, об эмбриологических наблюдениях путем очистки протоколов в семенах томатов не сообщалось. Это препятствует детальному исследованию эмбрионального и семенного развития томатов.

Хлоралгидрат обычно используется в качестве очищающего раствора, который позволяет погружаться тканям и клеткам отображаться на различных оптических плоскостях и по существу сохраняет клетки или тканевые компоненты 27,28,29. Протокол очистки на основе хлоралгидрата был успешно использован для очистки семян по всей установке для наблюдения за зародышем и эндоспермом Arabidopsis ^21,28. Однако этот очистительный раствор не эффективен при очистке семян томатов, которые более непроницаемы, чем семена арабидопсиса. Физические барьеры включают: (1) кожный покров томата имеет почти 20 клеточных слоев при 3-15 DAF^30,31, (2) эндосперм томата клеточного типа, а не ядерного типа³², и (3) семена томатов примерно в 70 раз больше по^{размеру 33,34} и (4) производят большое количество слизи семенной оболочки, что блокирует проникновение очищающих реагентов и влияет на визуализацию эмбриональных клеток.

Таким образом, в настоящем отчете представлен оптимизированный метод очистки на основе хлоралгидрата для полной очистки семян томатов на разных стадиях, который позволяет глубоко визуализировать процесс развития эмбриона (рисунок 2).

Protocol

1. Приготовление растворов Приготовьте фиксатор FAA, добавив 2,5 мл 37% формальдегида, 2,5 мл ледниковой уксусной кислоты и 45 мл 70% этанола в 50 мл центрифужной трубки. Вихрь и храните его при 4 °C. Только что приготовьте фиксатор FAA непосредственно перед использованием.ВНИМАНИЕ:…

Representative Results

Когда семена томатов очищали с использованием обычного метода, как в Arabidopsis, плотные клетки эндосперма блокировали визуализацию ранних эмбрионов томатов при 3 DAF и 6 DAF (рисунок 3A, B). По мере увеличения общего объема эмбриона шаровидный эмбрион был едва разли…

Discussion

По сравнению с механическим сечением, технология очистки более выгодна для трехмерной визуализации, поскольку она сохраняет целостность растительных тканей или органов¹⁶. Обычные протоколы очистки часто ограничиваются небольшими образцами из-за более легкого проникнове…

Materials

1,000 µL pipette	GILSON	FA10006M
1,000 µL pipette tips	Corning	T-1000-B
2 ml centrifuge tube	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehyde	DAMAO	685-2013
5,000 µL pipette	Eppendorf	3120000275
5,000 µL pipette tips	biosharp	BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bottle glass	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscope	Zeiss	Axio Imager A1	10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Flower nutrient soil	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Glacial Acetic Acid	BOYUAN	676-2007
Glycerol	Solarbio	G8190
Magnetic stirrer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbital shaker	QILINBEIER	QB-206
Seeding substrate	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Screening:0-10 mm
Single concave slide	HUABODEYI	HBDY1895
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscope	Leica	S8 APO	1x to 4x magnification
Tin foil	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vacuum pump	SHIDING	SHB-III
Vortex meter	Silogex	MX-S