Um Protocolo de Limpeza Eficiente para o Estudo do Desenvolvimento de Sementes em Tomateiro (Solanum lycopersicum L.)

Summary

A semente de tomate é um modelo importante para o estudo da genética e biologia do desenvolvimento durante a reprodução das plantas. Este protocolo é útil para a limpeza de sementes de tomate em diferentes estágios de desenvolvimento para observar a estrutura embrionária mais fina.

Abstract

O tomate (Solanum lycopersicum L.) é uma das principais culturas comerciais em todo o mundo. A semente de tomate é um modelo importante para o estudo da genética e biologia do desenvolvimento durante a reprodução das plantas. A visualização da estrutura embrionária mais fina dentro de uma semente de tomate é muitas vezes dificultada pela mucilagem do revestimento da semente, tegumento em camadas multicelulares e um endosperma de paredes espessas, que precisa ser resolvido por uma laboriosa seção de incorporação. Uma alternativa mais simples é empregar técnicas de limpeza de tecidos que tornam a semente quase transparente usando agentes químicos. Embora os procedimentos convencionais de limpeza permitam uma visão profunda de sementes menores com um revestimento de sementes mais fino, a limpeza de sementes de tomate continua a ser tecnicamente desafiadora, especialmente nos estágios finais de desenvolvimento.

Apresentamos aqui um protocolo de limpeza rápido e que economiza trabalho para observar o desenvolvimento de sementes de tomate de 3 a 23 dias após a floração, quando a morfologia embrionária está quase completa. Este método combina solução de limpeza à base de hidrato de cloral amplamente utilizada em Arabidopsis com outras modificações, incluindo a omissão de fixação de formalina-aceto-álcool (FAA), a adição de tratamento de hipoclorito de sódio de sementes, remoção da mucilagem de revestimento de sementes amolecida e lavagem e tratamento a vácuo. Este método pode ser aplicado para a limpeza eficiente de sementes de tomateiro em diferentes estágios de desenvolvimento e é útil no monitoramento completo do processo de desenvolvimento de sementes mutantes com boa resolução espacial. Este protocolo de limpeza também pode ser aplicado a imagens profundas de outras espécies comercialmente importantes nas Solanaceae.

Introduction

O tomate (S. lycopersicum L.) é uma das culturas vegetais mais importantes do mundo, com uma produção de 186,8 milhões de toneladas de frutos carnudos de 5,1 milhões de hectares em 2020¹. Pertence à grande família Solanaceae com cerca de 2.716 espécies², incluindo muitas culturas comercialmente importantes, como berinjela, pimenta, batata e tabaco. O tomateiro cultivado é uma espécie diploide (2n = 2x = 24) com um tamanho de genoma de aproximadamente 900 Mb³. Durante muito tempo, um grande esforço tem sido feito para a domesticação e reprodução do tomate, selecionando características desejáveis de Solanum spp selvagem. Existem mais de 5.000 acessos de tomate listados no Tomato Genetics Resource Center e mais de 80.000 germoplasma de tomates são armazenados em todo o mundo⁴. A planta de tomate é perene na estufa e se propaga por sementes. Uma semente de tomate madura consiste em três compartimentos principais: um embrião adulto, endosperma residual do tipo celular e um revestimento de sementes duras ^5,6 (Figura 1A). Após a dupla fertilização, o desenvolvimento de endospermas do tipo celular precede o desenvolvimento de zigotos. Em ~5-6 dias após a floração (DAF), o proembrião de duas células é observado pela primeira vez quando o endosperma consiste de seis a oito núcleos⁷. Em Solanum pimpinellifolium, o embrião se aproxima de seu tamanho final após 20 DAF, e as sementes são viáveis para germinação após 32 DAF⁸. À medida que o embrião se desenvolve, o endosperma é gradualmente absorvido e apenas uma pequena quantidade de endosperma permanece na semente. O endosperma residual consiste em endosperma micropilar ao redor da ponta da radícula e endosperma lateral no restante da semente ^9,10. O revestimento externo da semente é desenvolvido a partir da epiderme externa espessada e lignificada do tegumento e, com as camadas mortas de restos de tegumento, formam uma casca dura para proteger o embrião e o endosperma⁵.

Figura 1: Representação esquemática de uma semente madura em Solanum lycopersicum e Arabidopsis thaliana. (A) Anatomia longitudinal de uma semente de tomateiro madura. (B) Anatomia longitudinal de uma semente madura de Arabidopsis. Uma semente de tomate madura é aproximadamente 70 vezes maior em tamanho do que uma semente de Arabidopsis. Barras de escala = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A produção de sementes de tomate de alta qualidade depende da coordenação entre o embrião, o endosperma e os componentes maternos das sementes¹¹. Dissecar genes-chave e redes no desenvolvimento de sementes requer um registro fenotípico profundo e completo de sementes mutantes. Técnicas convencionais de embutimento-seccionamento, como a seção semifina e a seção de parafina, são amplamente aplicadas às sementes de tomateiro para observar as estruturas locais e mais finas do embrião^12,13,14,15. No entanto, a análise do desenvolvimento de sementes a partir de seções finas é geralmente trabalhosa e carece de resolução espacial do eixo z. Em comparação, a depuração tecidual é um método rápido e eficiente para identificar o estágio de desenvolvimento dos defeitos embrionários com maior probabilidade de ocorrer¹⁶. O método de clareamento reduz a opacidade do tecido interno homogeneizando o índice de refração com um ou mais agentes bioquímicos¹⁶. A limpeza de tecidos inteiros permite a observação de uma estrutura tecidual vegetal sem destruir sua integridade, e a combinação de tecnologia de clareamento e imagens tridimensionais tornou-se uma solução ideal para obter informações sobre a morfologia e o estado de desenvolvimento de um órgão vegetal^17,18. Ao longo dos anos, técnicas de limpeza de sementes têm sido utilizadas em várias espécies vegetais, incluindo Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare e Beta vulgaris^{19,20,21,22,23}. Dentre estas, a tecnologia de limpeza de óvulos de montagem completa tem sido uma abordagem eficiente para o estudo do desenvolvimento de sementes de Arabidopsis, devido ao seu pequeno tamanho, 4-5 camadas da célula do revestimento da semente e o endosperma do tipo nuclear^24,25. Com a atualização contínua de diferentes misturas de clareamento, como o surgimento da solução de Hoyer²⁶, as estruturas internas do óvulo de cevada foram fotografadas com alto grau de clareza, embora seu endosperma constitua a maior parte das sementes. A embriogênese da beterraba sacarina pode ser observada por limpeza combinada com tratamento a vácuo e amolecimento com ácido clorídrico¹⁹. No entanto, ao contrário das espécies mencionadas acima, observações embriológicas por protocolos de limpeza em sementes de tomate não foram relatadas. Isso evita uma investigação detalhada sobre o desenvolvimento embrionário e de sementes de tomates.

O hidrato de cloral é comumente utilizado como solução de clareamento que permite que os tecidos e células imersos sejam exibidos em diferentes planos ópticos, preserva substancialmente as células ou componentes teciduais^27,28,29. O protocolo de clareamento à base de hidrato de cloral tem sido utilizado com sucesso para a limpeza completa de sementes para observar o embrião e o endosperma de Arabidopsis^21,28. No entanto, esta solução de limpeza não é eficiente na limpeza de sementes de tomate, que são mais impermeáveis do que as sementes de Arabidopsis. As barreiras físicas incluem: (1) o tegumento do tomate tem quase 20 camadas celulares em 3 a 15 DAF 30,31, (2) o endosperma do tomate é do tipo celular, não do tipo nuclear 32, e (3) as sementes de tomate são cerca de 70 vezes maiores em tamanho^33,34 e (4) produzem grandes quantidades de mucilagem do revestimento da semente^, o que bloqueia a penetração de reagentes de limpeza e afeta a visualização das células embrionárias.

Portanto, este relato apresenta um método otimizado de clareamento à base de hidrato de cloral para limpeza integral de sementes de tomateiro em diferentes estágios, o que permite imagens profundas do processo de desenvolvimento embrionário (Figura 2).

Protocol

1. Preparação de soluções Preparar o fixador de FAA adicionando 2,5 mL de formaldeído a 37%, 2,5 mL de ácido acético glacial e 45 mL de etanol a 70% em um tubo de centrífuga de 50 mL. Vórtice e armazená-lo a 4 °C. Prepare recentemente o fixador FAA imediatamente antes de usar.CUIDADO: 37% de formaldeído é corrosivo e potencialmente cancerígeno se exposto ou inalado. O fixador deve ser realizado em um exaustor enquanto estiver usando o equipamento de proteção individual apro…

Representative Results

Quando as sementes de tomate foram limpas usando um método convencional como em Arabidopsis, os densos nódulos endospermáticos bloquearam a visualização de embriões de tomate precoces em 3 DAF e 6 DAF (Figura 3A,B). À medida que o volume total do embrião aumentava, um embrião globular era quase indistinguível a 9 DAF (Figura 3C). No entanto, à medida que o tamanho da semente continuou a aumentar, sua permeabilidade diminuiu, …

Discussion

Em comparação com o corte mecânico, a tecnologia de limpeza é mais vantajosa para imagens tridimensionais, pois mantém a integridade dos tecidos ou órgãos vegetais¹⁶. Os protocolos de limpeza convencionais são frequentemente limitados a pequenas amostras devido à penetração mais fácil de soluções químicas. A semente de tomate é uma amostra problemática para a limpeza de tecidos porque é cerca de 70 vezes maior do que uma semente de Arabidopsis em tamanho e tem mais barre…

Materials

1,000 µL pipette	GILSON	FA10006M
1,000 µL pipette tips	Corning	T-1000-B
2 ml centrifuge tube	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehyde	DAMAO	685-2013
5,000 µL pipette	Eppendorf	3120000275
5,000 µL pipette tips	biosharp	BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bottle glass	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscope	Zeiss	Axio Imager A1	10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Flower nutrient soil	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Glacial Acetic Acid	BOYUAN	676-2007
Glycerol	Solarbio	G8190
Magnetic stirrer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbital shaker	QILINBEIER	QB-206
Seeding substrate	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Screening:0-10 mm
Single concave slide	HUABODEYI	HBDY1895
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscope	Leica	S8 APO	1x to 4x magnification
Tin foil	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vacuum pump	SHIDING	SHB-III
Vortex meter	Silogex	MX-S