Isolering av hvilende stamcellepopulasjoner fra individuelle skjelettmuskler
Summary
Denne protokollen beskriver isolering av muskelstamceller og fibro-adipogene forfedre fra individuelle skjelettmuskler hos mus. Protokollen involverer enkel muskeldisseksjon, stamcelleisolering ved fluorescensaktivert cellesortering, renhetsvurdering ved immunfluorescensfarging og kvantitativ måling av S-faseinngang ved 5-etynyl-2′-deoksyuridininkorporeringsanalyse.
Abstract
Skjelettmuskulatur har forskjellige populasjoner av voksne stamceller som bidrar til homeostase og reparasjon av vevet. Skjelettmuskelstamceller (MuSC) har evnen til å lage nye muskler, mens fibro-adipogene progenitorer (FAP) bidrar til stromale støttevev og har evnen til å lage fibroblaster og adipocytter. Både MuSC og FAP befinner seg i en tilstand av langvarig reversibel cellesyklusutgang, kalt quiescence. Hviletilstanden er nøkkelen til deres funksjon. Hvilende stamceller blir ofte renset fra flere muskelvev samlet sammen i en enkelt prøve. Nylige studier har imidlertid avslørt tydelige forskjeller i molekylære profiler og hviledybde av MuSCs isolert fra forskjellige muskler. Denne protokollen beskriver isolering og studier av MuSCs og FAPs fra individuelle skjelettmuskler og presenterer strategier for å utføre molekylær analyse av stamcelleaktivering. Den beskriver hvordan man isolerer og fordøyer muskler av forskjellig utviklingsopprinnelse, tykkelser og funksjoner, som membran, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL) og massetermusklene. MuSC og FAP renses ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og analyseres ved immunfluorescensfarging og 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EdU) inkorporeringsanalyse.
Introduction
Skjelettmuskulatur har høy kapasitet for regenerering på grunn av tilstedeværelsen av muskelstamceller (MuSC). MuSCs er lokalisert på myofibrene, under basal lamina, og ligger i en hviletilstand av langvarig, reversibel cellesyklusutgang 1,2,3,4. Ved skade aktiveres MuSC og går inn i cellesyklusen for å gi opphav til forsterkende progenitorer som kan differensiere og smelte sammen for å danne nye myofibre 2,5. Tidligere arbeid har vist at MuSCs er helt avgjørende for muskelregenerering 6,7,8. Videre kan en enkelt MuSC engraft og generere både nye stamceller og nye myofibre9. Skjelettmuskulaturen har også en populasjon av mesenkymale stromale celler kalt fibro-adipogene progenitorer (FAP), som spiller en avgjørende rolle i å støtte MuSC-funksjonen under muskelregenerering 6,10,11,12.
På grunn av deres potensial til å koordinere muskelregenerering, har det vært enorm interesse for å forstå hvordan MuSCs og FAPs fungerer. Hvilende MuSC er preget av ekspresjon av transkripsjonsfaktorene Pax7 og Sprouty1, og celleoverflateproteinkalsitoninreseptoren, mens hvilende FAP er preget av celleoverflateproteinblodplatederivert vekstfaktorreseptor alfa (PDGFRa)10,12,13,14,15. Tidligere studier har vist at MuSCs og FAPs kunne renses fra skjelettmuskler ved hjelp av celleoverflatemarkører og fluorescensaktivert cellesortering (FACS) 9,15,16,17,18,19,20,21. Selv om disse protokollene i stor grad har forbedret evnen til å studere MuSCs og FAPs, er en ulempe at de fleste av disse protokollene krever isolering av MuSCs fra et basseng av forskjellige muskelvev. Nylig arbeid fra oss og andre har avslørt forskjeller i cellefenotype og genuttrykksnivåer mellom MuSCs isolert fra forskjellige vev22,23. MuSC fra diafragma, triceps og gracilis viser raskere aktivering enn MuSC fra nedre baklemsmuskulatur22, mens MuSC fra ekstraokulær muskulatur viser raskere differensiering enn MuSC fra mellomgulvet og nedre bakkroppsmuskulatur23.
Denne protokollen beskriver isolering av MuSCs og FAPs fra individuelle skjelettmuskler (figur 1). Dette inkluderer disseksjon av membranen, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius (GA) og masseter muskler. Dissekerte muskler dissosieres deretter ved enzymatisk fordøyelse ved bruk av kollagenase II (en protease som spesifikt retter seg mot Pro-X-Gly-Pro-aminosekvensen i kollagen, noe som muliggjør nedbrytning av bindevev og vevsdissosiasjon24) og dispase (en protease som spalter fibronektin og kollagen IV, noe som muliggjør ytterligere celledissosiasjon25). MuSCs og FAPs er isolert fra enkeltcelle suspensjoner av FACS. Som eksempler på nedstrømsanalyser for celleanalyse bestemmes stamcelleaktivering ved å analysere 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EdU) inkorporering, mens cellerenhet bestemmes ved immunfluorescensfarging for celletypespesifikke markører Pax7 og PDGFRa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere trinn er nøkkelen i gjennomføringen av denne protokollen for å oppnå gode utbytter. De enkelte musklene har et lite volum sammenlignet med mengden muskel som brukes i bulkisolasjonsprotokoller. Dette medfører risiko for at muskelen tørker ut under disseksjonen, noe som reduserer utbyttet. For å forhindre dette er det viktig å legge medium til musklene umiddelbart etter disseksjon. I tillegg, hvis disseksjon tar lengre tid, kan huden fjernes fra ett lem om gangen for å redusere tiden for eksponering av musk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cellesortering ble utført ved FACS Core Facility, Aarhus Universitet, Danmark. Figurer ble opprettet ved hjelp av Biorender.com. Vi takker Dr. J. Farup for å dele kaninen anti-PDGFRa antistoff. Dette arbeidet ble støttet av et AUFF Starting Grant til E.P. og Start Package tilskudd fra NovoNordiskFonden til E.P. (0071113) og til A.D.M. (0071116).
Materials
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
- Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Fukada, S. -. I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
- Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
- Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
- de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
- Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
- Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
- Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
- Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
- Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
- de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).
