Isolering av vilande stamcellspopulationer från enskilda skelettmuskler
Summary
Detta protokoll beskriver isoleringen av muskelstamceller och fibro-adipogenic progenitorer från enskilda skelettmuskler hos möss. Protokollet innefattar dissektion av enstaka muskler, stamcellsisolering genom fluorescensaktiverad cellsortering, renhetsbedömning genom immunofluorescensfärgning och kvantitativ mätning av S-fasinträde med 5-etynyl-2′-deoxiuridininkorporeringsanalys.
Abstract
Skelettmuskulaturen har distinkta populationer av vuxna stamceller som bidrar till homeostas och reparation av vävnaden. Skelettmuskelstamceller (MuSC) har förmågan att skapa nya muskler, medan fibro-adipogenic progenitorer (FAPs) bidrar till stromala stödvävnader och har förmågan att göra fibroblaster och adipocyter. Både MuSC och FAP ligger i ett tillstånd av långvarig reversibel cellcykelutgång, kallad quiescence. Det vilande tillståndet är nyckeln till deras funktion. Vilande stamceller renas vanligen från flera muskelvävnader som slås samman i ett enda prov. Nya studier har dock avslöjat tydliga skillnader i molekylära profiler och vilodjup hos MuSCs isolerade från olika muskler. Detta protokoll beskriver isolering och studier av MuSC och FAP från enskilda skelettmuskler och presenterar strategier för att utföra molekylär analys av stamcellsaktivering. Den beskriver hur man isolerar och smälter muskler av olika utvecklingsursprung, tjocklekar och funktioner, såsom membranet, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL) och massetermusklerna. MuSC och FAP renas genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och analyseras genom immunofluorescensfärgning och 5-etynyl-2′-deoxiuridin (EdU) inkorporeringsanalys.
Introduction
Skelettmuskulaturen har en hög kapacitet för regenerering på grund av närvaron av muskelstamceller (MuSC). MuSCs är belägna på myofibrerna, under basallamina, och ligger i ett vilande tillstånd av långvarig, reversibel cellcykelutgång 1,2,3,4. Vid skada aktiveras MuSCs och går in i cellcykeln för att ge upphov till förstärkande föregångare som kan differentiera och smälta samman för att bilda nya myofibrer 2,5. Tidigare arbete har visat att MuSCs är absolut nödvändiga för muskelregenerering 6,7,8. Dessutom kan en enda MuSC transplantera och generera både nya stamceller och nya myofibrer9. Skelettmuskulaturen har också en population av mesenkymala stromaceller som kallas fibro-adipogenic progenitors (FAPs), som spelar en avgörande roll för att stödja MuSC-funktionen under muskelregenerering 6,10,11,12.
På grund av deras potential att samordna muskelregenerering har det varit ett enormt intresse för att förstå hur MuSC och FAP fungerar. Vilande MuSCs markeras genom uttryck av transkriptionsfaktorerna Pax7 och Sprouty1 och cellyteproteinkalcitoninreceptorn, medan vilande FAP markeras av cellytans proteintrombocythärledda tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRa)10,12,13,14,15. Tidigare studier har visat att MuSC och FAP kunde renas från skelettmuskulaturen med hjälp av cellytemarkörer och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Även om dessa protokoll har avancerat förmågan att studera MuSC och FAP, är en nackdel att de flesta av dessa protokoll kräver isolering av MuSC från en pool av olika muskelvävnader. Nyligen arbete från oss och andra har avslöjat skillnader i cellfenotyp och genuttrycksnivåer mellan MuSCs isolerade från olika vävnader22,23. MuSCs från membranet, triceps och gracilis visar snabbare aktivering än MuSCs från nedre bakbensmusklerna22, medan MuSCs från extraokulär muskel visar snabbare differentiering än MuSCs från membranet och nedre bakbensmusklerna23.
Detta protokoll beskriver isoleringen av MuSC och FAP från enskilda skelettmuskler (figur 1). Detta inkluderar dissektion av membranet, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius (GA) och massetermuskler. Dissekerade muskler dissocieras därefter genom enzymatisk nedbrytning med användning av kollagenas II (ett proteas som specifikt riktar sig mot Pro-X-Gly-Pro-aminosekvensen i kollagen, vilket möjliggör nedbrytning av bindväv och vävnadsdissociation24) och dispas (ett proteas som klyver fibronektin och kollagen IV, vilket möjliggör ytterligare celldissociation25). MuSC och FAP isoleras från encellssuspensioner av FACS. Som exempel på nedströmsanalyser för cellanalys bestäms stamcellsaktivering genom analys av 5-etynyl-2′-deoxiuridin (EdU) inkorporering, medan cellrenhet bestäms genom immunofluorescensfärgning för celltypspecifika markörer Pax7 och PDGFRa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera steg är nyckeln till genomförandet av detta protokoll för att uppnå god avkastning. De enskilda musklerna har en liten volym jämfört med mängden muskler som används i bulkisoleringsprotokoll. Detta resulterar i en risk för att muskeln torkar ut under dissektionen, vilket minskar avkastningen. För att förhindra detta är det viktigt att lägga till medium i musklerna omedelbart efter dissektion. Dessutom, om dissektion tar längre tid, kan huden avlägsnas från en lem i taget för att minska tiden för e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cellsortering utfördes vid FACS Core Facility, Århus universitet, Danmark. Siffror skapades med hjälp av Biorender.com. Vi tackar Dr. J. Farup för att dela kaninanti-PDGFRa-antikroppen. Detta arbete stöddes av ett AUFF Starting Grant till E.P. och Start Package bidrag från NovoNordiskFonden till E.P. (0071113) och A.D.M. (0071116).
Materials
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
- Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Fukada, S. -. I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
- Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
- Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
- de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
- Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
- Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
- Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
- Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
- Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
- de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).
