Zebrafish Tol2-systemet: En modulær og fleksibel gateway-baseret transgenesetilgang
Summary
Dette arbejde beskriver en protokol for det modulære Tol2 transgenesesystem, en gateway-baseret kloningsmetode til at skabe og injicere transgene konstruktioner i zebrafiskembryoner.
Abstract
Føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) er kendetegnet ved et meget variabelt sæt strukturelle defekter og kognitive svækkelser, der opstår på grund af prænatal ethanoleksponering. På grund af FASD’s komplekse patologi har dyremodeller vist sig at være afgørende for vores nuværende forståelse af ethanol-inducerede udviklingsfejl. Zebrafisk har vist sig at være en stærk model til at undersøge ethanol-inducerede udviklingsfejl på grund af den høje grad af bevarelse af både genetik og udvikling mellem zebrafisk og mennesker. Som modelsystem besidder zebrafisk mange egenskaber, der gør dem ideelle til udviklingsstudier, herunder et stort antal eksternt befrugtede embryoner, der er genetisk medgørlige og gennemskinnelige. Dette giver forskere mulighed for præcist at kontrollere timingen og doseringen af ethanoleksponering i flere genetiske sammenhænge. Et vigtigt genetisk værktøj, der er tilgængeligt i zebrafisk, er transgenese. Imidlertid kan generering af transgene konstruktioner og etablering af transgene linjer være kompleks og vanskelig. For at løse dette problem har zebrafiskforskere etableret det transposonbaserede Tol2-transgenesesystem. Dette modulære system bruger en multisite Gateway-kloningsmetode til hurtig samling af komplette Tol2-transposonbaserede transgene konstruktioner. Her beskriver vi den fleksible Tol2-systemværktøjskasse og en protokol til generering af transgene konstruktioner, der er klar til zebrafisktransgenese og deres anvendelse i ethanolstudier.
Introduction
Prænatal ethanoleksponering giver anledning til et kontinuum af strukturelle underskud og kognitive svækkelser kaldet føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD)1,2,3,4. De komplekse forhold mellem flere faktorer gør det udfordrende at studere og forstå ætiologien af FASD hos mennesker. For at løse denne udfordring er der anvendt en lang række dyremodeller. De biologiske og eksperimentelle værktøjer, der er tilgængelige i disse modeller, har vist sig afgørende for at udvikle vores forståelse af det mekanistiske grundlag for ethanolteratogenicitet, og resultaterne fra disse modelsystemer har været bemærkelsesværdigt konsistente med, hvad der findes i humane ethanolstudier 5,6. Blandt disse har zebrafisk vist sig som en stærk model til at studere ethanol teratogenese7,8, dels på grund af deres ydre befrugtning, høj frugtbarhed, genetisk trækbarhed og gennemskinnelige embryoner. Disse styrker kombineres for at gøre zebrafisk ideel til realtids live imaging undersøgelser af FASD ved hjælp af transgene zebrafisklinjer.
Transgene zebrafisk er blevet flittigt brugt til at studere flere aspekter af embryonal udvikling9. Imidlertid kan det være yderst vanskeligt at skabe transgene konstruktioner og efterfølgende transgene linjer. Et standardtransgen kræver et aktivt promotorelement til at drive transgenet og et poly A-signal eller “hale”, alt sammen i en stabil bakterievektor til generel vektorvedligeholdelse. Den traditionelle generation af en transgen multikomponent konstruktion kræver flere tidskrævende underkloningstrin10. PCR-baserede tilgange, såsom Gibson-samling, kan omgå nogle af de problemer, der er forbundet med underkloning. Imidlertid skal unikke primere designes og testes til generering af enhver unik transgen konstruktion10. Ud over transgenkonstruktion har genomisk integration, kimlinjeoverførsel og screening for korrekt transgenintegration også været vanskelig. Her beskriver vi en protokol til brug af det transposonbaserede Tol2-transgenesesystem (Tol2Kit)10,11. Dette modulære system bruger multisite Gateway-kloning til hurtigt at generere flere transgene konstruktioner fra et stadigt voksende bibliotek med “entry” og “destination” vektorer. Integrerede Tol2 transponerbare elementer øger transgenesehastigheden kraftigt, hvilket muliggør hurtig konstruktion og genomisk integration af flere transgener. Ved hjælp af dette system viser vi, hvordan dannelsen af en endoderm transgen zebrafiskelinje kan bruges til at studere de vævsspecifikke strukturelle defekter, der ligger til grund for FASD. I sidste ende viser vi i denne protokol, at den modulære opsætning og konstruktionen af transgene konstruktioner i høj grad vil hjælpe zebrafiskbaseret FASD-forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisk er ideelle til at studere virkningen af ethanoleksponering på udvikling og sygdomstilstande 7,8. Zebrafisk producerer et stort antal gennemsigtige, eksternt befrugtede, genetisk medgørlige embryoner, hvilket muliggør levende billeddannelse af flere transgenmærkede væv og celletyper samtidigt i flere miljøsammenhænge19,20. Disse styrker kombineret med den stærke udviklingsmæssige genetis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen præsenteret i denne artikel blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 til CBL.
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017)
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
