Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식
Summary
이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)는 태아기 에탄올 노출로 인해 발생하는 매우 다양한 구조적 결함 및 인지 장애가 특징입니다. FASD의 복잡한 병리로 인해 동물 모델은 에탄올로 인한 발달 결함에 대한 현재의 이해에 중요한 것으로 입증되었습니다. Zebrafish는 제브라피쉬와 인간 사이의 유전학 및 발달 모두의 높은 수준의 보존으로 인해 에탄올로 인한 발달 결함을 조사하는 강력한 모델임이 입증되었습니다. 모델 시스템으로서 제브라피쉬는 유전적으로 다루기 쉽고 반투명한 많은 수의 외부 수정 배아를 포함하여 발달 연구에 이상적인 많은 특성을 가지고 있습니다. 이를 통해 연구자들은 여러 유전적 맥락에서 에탄올 노출의 시기와 투여량을 정확하게 제어할 수 있습니다. 제브라피쉬에서 사용할 수 있는 중요한 유전 도구 중 하나는 형질전환입니다. 그러나 형질전환 구조체를 생성하고 형질전환 계통을 설정하는 것은 복잡하고 어려울 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 제브라피쉬 연구자들은 트랜스포존 기반 Tol2 형질전환 시스템을 구축했습니다. 이 모듈식 시스템은 완전한 Tol2 트랜스포존 기반 형질전환 구조의 빠른 조립을 위해 다중 사이트 게이트웨이 클로닝 접근 방식을 사용합니다. 여기에서는 유연한 Tol2 시스템 도구 상자와 제브라피쉬 형질전환을 위한 준비가 된 형질전환 구조를 생성하고 에탄올 연구에서의 사용을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
Introduction
태아기 에탄올 노출은 태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)라고 하는 구조적 결함 및 인지 장애의 연속체를 유발합니다.1,2,3,4. 여러 요인 간의 복잡한 관계는 인간에서 FASD의 병인을 연구하고 이해하는 것을 어렵게 만듭니다. 이 문제를 해결하기 위해 다양한 동물 모델이 사용되었습니다. 이 모델에서 사용할 수 있는 생물학적 및 실험적 도구는 에탄올 기형 유발성의 기계론적 기초에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요한 것으로 입증되었으며, 이러한 모델 시스템의 결과는 인간 에탄올 연구에서 발견된 것과 현저하게 일치했습니다 5,6. 이 중 제브라피쉬는 에탄올 기형 형성을 연구하는 강력한 모델로 부상했습니다.7,8, 부분적으로는 외부 수정, 높은 번식력, 유전적 다루기 쉬움 및 반투명 배아로 인해 발생합니다. 이러한 강점이 결합되어 제브라피쉬는 형질전환 제브라피쉬 계통을 사용한 FASD의 실시간 라이브 이미징 연구에 이상적입니다.
형질전환 제브라피쉬는 배아 발달의 여러 측면을 연구하는 데 광범위하게 사용되어 왔다9. 그러나 형질전환 구조체 및 후속 형질전환 계통을 만드는 것은 매우 어려울 수 있습니다. 표준 이식유전자는 이식유전자를 구동하기 위한 활성 프로모터 요소와 폴리 A 신호 또는 “꼬리”를 필요로 하며, 모두 일반적인 벡터 유지를 위해 안정적인 박테리아 벡터에서 필요합니다. 다성분 형질전환 구축물의 전통적인 생성은 여러 시간이 소요되는 서브클로닝 단계(sub-cloning steps)를 필요로 한다(10). Gibson 어셈블리와 같은 PCR 기반 접근 방식은 하위 복제와 관련된 일부 문제를 우회할 수 있습니다. 그러나, 독특한 프라이머는 모든 독특한 형질전환 구축물10의 생성을 위해 설계되고 시험되어야 한다. 이식유전자 구성 외에도 게놈 통합, 생식계열 전달 및 적절한 이식유전자 통합을 위한 스크리닝도 어려웠습니다. 여기서는 트랜스포존 기반 Tol2 형질전환 시스템(Tol2Kit)을 사용하기 위한 프로토콜을 설명합니다(10,11). 이 모듈식 시스템은 다중 사이트 게이트웨이 클로닝을 사용하여 계속 확장되는 “진입” 및 “대상” 벡터 라이브러리에서 여러 형질전환 구조를 신속하게 생성합니다. 통합된 Tol2 전치 가능한 요소는 형질전환 속도를 크게 증가시켜 여러 형질전환 유전자의 신속한 구성 및 게놈 통합을 가능하게 합니다. 이 시스템을 사용하여 우리는 내배엽 형질전환 제브라피쉬 계통의 생성이 FASD의 기초가 되는 조직 특이적 구조적 결함을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 궁극적으로, 이 프로토콜에서 우리는 모듈식 설정과 형질전환 구조의 구성이 제브라피쉬 기반 FASD 연구에 크게 도움이 될 것임을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish는 에탄올 노출이 발달 및 질병 상태에 미치는 영향을 연구하는 데 이상적입니다 7,8. 제브라피쉬는 반투명하고, 외부 수정되고, 유전적으로 다루기 쉬운 배아를 대량으로 생산하며, 이를 통해 여러 환경적 맥락에서 여러 이식유전자 표지 조직 및 세포 유형을 동시에 생생하게 이미징할 수 있다19,20. 이?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 기사에 제시된 연구는 국립 보건원/국립 알코올 남용 연구소(NIH/NIAAA) R00AA023560에서 CBL에 대한 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
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