ثقافة طويلة الأجل ومراقبة Caenorhabditis elegans المعزولة على الوسائط الصلبة في الأجهزة متعددة الآبار
Summary
يظهر هنا بروتوكول محسن لزراعة الديدان الخيطية الفردية المعزولة على وسائط صلبة في أجهزة متعددة الآبار دقيقة الصنع. يسمح هذا النهج بمراقبة الحيوانات الفردية طوال حياتها لمجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية المتعلقة بالشيخوخة والصحة ، بما في ذلك النشاط وحجم الجسم وشكله وهندسة الحركة والبقاء على قيد الحياة.
Abstract
تعد الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans من بين أكثر الأنظمة النموذجية شيوعا المستخدمة في أبحاث الشيخوخة نظرا لتقنيات الاستزراع البسيطة وغير المكلفة ، ودورة التكاثر السريع (~ 3 أيام) ، والعمر القصير (~ 3 أسابيع) ، والعديد من الأدوات المتاحة للتلاعب الجيني والتحليل الجزيئي. النهج الأكثر شيوعا لإجراء دراسات الشيخوخة في C. elegans ، بما في ذلك تحليل البقاء على قيد الحياة ، ينطوي على زراعة مجموعات من عشرات إلى مئات الحيوانات معا على وسائط نمو الديدان الخيطية الصلبة (NGM) في لوحات بتري. بينما يجمع هذا النهج بيانات عن مجموعة من الحيوانات ، فإن معظم البروتوكولات لا تتعقب الحيوانات الفردية بمرور الوقت. يظهر هنا بروتوكول محسن للاستزراع طويل الأجل للحيوانات الفردية على أجهزة بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) المصنعة تسمى WorMotels. يسمح كل جهاز باستزراع ما يصل إلى 240 حيوانا في آبار صغيرة تحتوي على NGM ، مع عزل كل بئر بواسطة خندق يحتوي على كبريتات النحاس يمنع الحيوانات من الفرار. بناء على وصف WorMotel الأصلي ، توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لقولبة كل جهاز وإعداده وتعبئته ، مع وصف للمضاعفات الفنية الشائعة ونصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. ضمن هذا البروتوكول ، توجد تقنيات للتحميل المتسق ل NGM صغير الحجم ، والتجفيف المتسق لكل من NGM والأغذية البكتيرية ، وخيارات لتقديم التدخلات الدوائية ، والتعليمات والقيود العملية لإعادة استخدام أجهزة PDMS ، ونصائح لتقليل الجفاف ، حتى في البيئات منخفضة الرطوبة. تسمح هذه التقنية بالمراقبة الطولية لمختلف المعلمات الفسيولوجية ، بما في ذلك النشاط المحفز ، والنشاط غير المحفز ، وحجم الجسم ، وهندسة الحركة ، والعمر الصحي ، والبقاء على قيد الحياة ، في بيئة مشابهة للتقنية القياسية للثقافة الجماعية على الوسائط الصلبة في ألواح بتري. تتوافق هذه الطريقة مع جمع البيانات عالية الإنتاجية عند استخدامها جنبا إلى جنب مع برامج الفحص المجهري والتحليل الآلي. أخيرا ، تمت مناقشة قيود هذه التقنية ، بالإضافة إلى مقارنة هذا النهج بطريقة تم تطويرها مؤخرا تستخدم الصواني الدقيقة لاستزراع الديدان الخيطية المعزولة على الوسائط الصلبة.
Introduction
يشيع استخدام Caenorhabditis elegans في دراسات الشيخوخة بسبب وقت جيلها القصير (حوالي 3 أيام) ، وقصر عمرها (حوالي 3 أسابيع) ، وسهولة الزراعة في المختبر ، ودرجة عالية من الحفظ التطوري للعمليات الجزيئية والمسارات مع الثدييات ، والتوافر الواسع لتقنيات التلاعب الجيني. في سياق دراسات الشيخوخة ، تسمح C. elegans بالتوليد السريع لبيانات طول العمر والسكان المسنين لتحليل الأنماط الظاهرية المتأخرة في الحيوانات الحية. يتضمن النهج النموذجي لإجراء دراسات شيخوخة الديدان القياس اليدوي لعمر مجموعة من الديدان المحفوظة في مجموعات من 20 إلى 70 حيوانا على وسائط نمو نيماتودا أجار صلبة (NGM) في ألواح بتري 6 سم1. يسمح استخدام المجموعات المتزامنة مع العمر بقياس العمر أو الأنماط الظاهرية المستعرضة في الحيوانات الفردية عبر السكان ، ولكن هذه الطريقة تمنع مراقبة خصائص الحيوانات الفردية بمرور الوقت. هذا النهج هو أيضا كثيفة العمالة ، وبالتالي تقييد حجم السكان الذين يمكن اختبارهم.
هناك عدد محدود من طرق الاستزراع التي تسمح بالمراقبة الطولية ل C. elegans الفردية طوال حياتها ، ولكل منها مجموعة مميزة من المزايا والعيوب. تسمح أجهزة الموائع الدقيقة ، بما في ذلك WormFarm2 و NemaLife3 وشريحة “السلوك”4 ، من بين أجهزة أخرى5،6،7 ، بمراقبة الحيوانات الفردية بمرور الوقت. وبالمثل ، فإن استزراع الديدان في الاستزراع السائل باستخدام ألواح متعددة الآبار يسمح بمراقبة الحيوانات الفردية أو مجموعات صغيرة من C. elegans بمرور الوقت 8,9. تمثل البيئة السائلة سياقا بيئيا متميزا عن بيئة الثقافة الشائعة على الوسائط الصلبة في ألواح بتري ، والتي يمكن أن تغير جوانب فسيولوجيا الحيوان ذات الصلة بالشيخوخة ، بما في ذلك محتوى الدهون والتعبير عن جينات الاستجابة للإجهاد10،11. القدرة على مقارنة هذه الدراسات مباشرة بغالبية البيانات التي تم جمعها عن الشيخوخة C. elegans محدودة بسبب الاختلافات في المتغيرات البيئية المهمة المحتملة. Worm Corral12 هو أحد الأساليب التي تم تطويرها لإيواء الحيوانات الفردية في بيئة تكرر بشكل أوثق ثقافة الوسائط الصلبة النموذجية. يحتوي Worm Corral على غرفة محكمة الغلق لكل على شريحة مجهرية باستخدام هيدروجيل ، مما يسمح بالمراقبة الطولية للحيوانات المعزولة. تستخدم هذه الطريقة التصوير القياسي برايت فيلد لتسجيل البيانات المورفولوجية ، مثل حجم الجسم ونشاطه. ومع ذلك ، يتم وضع الحيوانات في بيئة هيدروجيل كأجنة ، حيث تظل دون إزعاج طوال حياتها. وهذا يتطلب استخدام خلفيات وراثية متحولة أو محورة وراثيا معقمة مشروطا ، مما يحد من القدرة على الفحص الجيني ، حيث يجب عبور كل طفرة جديدة أو جين تحوير إلى خلفية ذات عقم مشروط ، والقدرة على فحص الأدوية ، حيث لا يمكن تطبيق العلاجات إلا مرة واحدة على الحيوانات كأجنة.
تسمح طريقة بديلة طورها مختبر Fang-Yen بزراعة الديدان على الوسائط الصلبة في الآبار الفردية لجهاز polydimethylsiloxane (PDMS) الدقيق يسمى WorMotel13,14. يتم وضع كل جهاز في صينية بئر واحدة (أي بنفس أبعاد لوحة 96 بئرا) ويحتوي على 240 بئرا مفصولة بخندق مملوء بمحلول مكروه لمنع الديدان من الانتقال بين الآبار. يمكن لكل بئر إيواء دودة واحدة طوال فترة حياتها. الجهاز محاط بكريات جل بولي أكريلاميد الممتصة للماء (يشار إليها باسم “بلورات الماء”) ، ويتم إغلاق الدرج بفيلم مختبر Parafilm للحفاظ على الرطوبة وتقليل جفاف الوسائط. يسمح هذا النظام بجمع بيانات الصحة والعمر للحيوانات الفردية ، في حين أن استخدام الوسائط الصلبة يلخص بشكل أفضل البيئة التي تعاني منها الحيوانات في الغالبية العظمى من دراسات عمر C. elegans المنشورة ، مما يسمح بمزيد من المقارنات المباشرة. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير تقنية مماثلة باستخدام صواني البوليسترين الدقيقة التي كانت تستخدم في الأصل لمقايسات السمية المجهرية15 بدلا من جهاز PDMS16. تسمح طريقة microtray بجمع البيانات الفردية للديدان المستزرعة على وسائط صلبة وقد حسنت القدرة على احتواء الديدان في ظل ظروف من شأنها أن تسبب عادة الفرار (على سبيل المثال ، الضغوطات أو القيود الغذائية) ، مع المفاضلة هي أن كل microtray يمكن أن تحتوي فقط على 96 حيوانا16 ، في حين أن الجهاز متعدد الآبار المستخدم هنا يمكن أن يحتوي على ما يصل إلى 240 حيوانا.
يظهر هنا بروتوكول مفصل لإعداد الأجهزة متعددة الآبار التي تم تحسينها من أجل الاتساق من لوحة إلى أخرى وإعداد أجهزة متعددة بالتوازي. تم تكييف هذا البروتوكول من البروتوكول الأصلي من مختبر Fang-Yen13. على وجه التحديد ، هناك أوصاف لتقنيات لتقليل التلوث ، وتحسين التجفيف المتسق لكل من الوسائط الصلبة ومصدر الغذاء البكتيري ، وتقديم RNAi والأدوية. يمكن استخدام هذا النظام لتتبع الصحة الفردية والعمر والأنماط الظاهرية الأخرى ، مثل حجم الجسم وشكله. تتوافق هذه الأجهزة متعددة الآبار مع الأنظمة عالية الإنتاجية الحالية لقياس العمر الافتراضي ، والتي يمكن أن تزيل الكثير من العمل اليدوي المتضمن في تجارب العمر التقليدية وتوفر الفرصة لقياس طول العمر الآلي والمباشر وتتبع الصحة في C. elegans الفردية على نطاق واسع.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد نظام WorMotel أداة قوية لجمع البيانات الفردية لمئات من C. elegans المعزولة بمرور الوقت. بعد الدراسات السابقة التي استخدمت أجهزة متعددة الآبار للتطبيقات في السكون التنموي والسلوك الحركي والشيخوخة ، كان الهدف من هذا العمل هو تحسين إعداد الأجهزة متعددة الآبار للمراقبة طويلة الأجل للنشاط و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل NIH R35GM133588 إلى G.L.S. ، وهي جائزة محفز من الأكاديمية الوطنية الأمريكية للطب إلى G.L.S. ، وصندوق مبادرة التكنولوجيا والبحوث في ولاية أريزونا الذي يديره مجلس حكام أريزونا ، ومؤسسة إليسون الطبية.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
References
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Freitas, S. Worm Paparazzi – A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , (2021).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
- Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
- Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
- McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
- Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
- Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
- Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
