Summary
ここには、微細加工されたマルチウェルデバイスの固体培地上で単離された個々の線虫を培養するための最適化されたプロトコルが提示されます。このアプローチにより、個々の動物を生涯を通じて監視して、活動、体のサイズと形状、運動の形状、生存など、老化と健康に関連するさまざまな表現型を確認できます。
Abstract
線虫 Caenorhabditis elegansは 、そのシンプルで安価な培養技術、迅速な繁殖サイクル(~3日)、短い寿命(~3週間)、および遺伝子操作と分子分析のための多数の利用可能なツールにより、老化研究で使用される最も一般的なモデルシステムの1つです。生存分析を含む C.エレガンスの老化研究を実施するための最も一般的なアプローチは、ペトリプレートの固体線虫増殖培地(NGM)上で数十〜数百匹の動物の集団を一緒に培養することです。このアプローチは動物の集団に関するデータを収集しますが、ほとんどのプロトコルは個々の動物を経時的に追跡しません。ここでは、WorMotelsと呼ばれる微細加工ポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイスで個々の動物を長期間培養するための最適化されたプロトコルを紹介します。各装置では、NGMを含む小さなウェルで最大240匹の動物を培養でき、各ウェルは硫酸銅を含む堀で分離され、動物が逃げるのを防ぎます。このホワイト ペーパーでは、元の WorMotel の説明に基づいて、各デバイスの成形、準備、および装着に関する詳細なプロトコルを提供し、一般的な技術的問題の説明とトラブルシューティングのアドバイスを提供します。このプロトコルには、少量のNGMの一貫した負荷、NGMと細菌性食品の両方の一貫した乾燥、薬理学的介入を提供するためのオプション、PDMSデバイスの再利用に関する指示と実際的な制限、および低湿度環境でも乾燥を最小限に抑えるためのヒントがあります。この技術により、ペトリプレートの固体培地での集団培養の標準的な技術と同様の環境で、刺激された活動、刺激されていない活動、体のサイズ、運動形状、健康寿命、生存など、さまざまな生理学的パラメーターの縦断的モニタリングが可能になります。この方法は、自動顕微鏡および分析ソフトウェアと組み合わせて使用 すると、ハイスループットデータ収集と互換性があります。最後に、この技術の限界、およびマイクロトレイを使用して単離された線虫を固体培地上で培養する最近開発された方法とのこのアプローチの比較について説明します。
Introduction
Caenorhabditis elegans は、その短い世代時間(約3日)、短い寿命(約3週間)、実験室での培養の容易さ、哺乳類との分子プロセスと経路の高度な進化的保存、および遺伝子操作技術の幅広い利用可能性のために、老化研究で一般的に使用されます。老化研究の文脈では、 C.エレガンスは 、生きている動物の晩年の表現型の分析のために、長寿データと高齢者集団の迅速な生成を可能にします。ワーム老化研究を実施するための典型的なアプローチは、6cmペトリプレート内の固体寒天線虫増殖培地(NGM)上で20〜70匹の動物のグループで維持されているワームの集団の寿命を手動で測定することを含む1。年齢同期集団を使用すると、集団全体の個々の動物の寿命または断面表現型を測定できますが、この方法では、個々の動物の特性を経時的に監視することはできません。このアプローチも労働集約的であるため、テストできる母集団のサイズが制限されます。
個々のC.エレガンスの寿命を通して縦断的にモニタリングできる培養方法は限られており、それぞれに異なる長所と短所があります。WormFarm2、NemaLife3、および「挙動」チップ4、とりわけ5,6,7を含むマイクロ流体デバイスは、個々の動物の経時的なモニタリングを可能にする。マルチウェルプレートを使用して液体培養でワームを培養することも同様に、個々の動物またはC.エレガンスの小さな集団のいずれかを経時的にモニタリングすることを可能にします8,9。液体環境は、ペトリプレートの固体培地上の一般的な培養環境とは異なる環境状況を表しており、脂肪含有量やストレス応答遺伝子の発現など、老化に関連する動物生理学の側面を変える可能性があります10,11。これらの研究を、老化したC.エレガンスについて収集されたデータの大部分と直接比較する能力は、潜在的に重要な環境変数の違いによって制限されます。Worm Corral12は、典型的な固体培地培養をより厳密に再現する環境で個々の動物を収容するために開発された1つのアプローチです。Worm Corralには、ヒドロゲルを使用した顕微鏡スライド上に各動物用の密閉チャンバーが含まれており、孤立した動物の縦方向のモニタリングが可能です。この方法では、標準的な明視野イメージングを使用して、体のサイズや活動などの形態学的データを記録します。しかしながら、動物は胚としてヒドロゲル環境に置かれ、そこでそれらは生涯を通じて邪魔されないままである。これには、条件付き無菌変異体またはトランスジェニック遺伝的背景の使用が必要であり、各新規変異または導入遺伝子を条件付き不妊でバックグラウンドに交配する必要があるため、遺伝子スクリーニングの能力と、治療は胚として動物に一度しか適用できないため、薬物スクリーニングの能力の両方が制限されます。
Fang-Yenラボによって開発された代替方法は、WorMotel13,14と呼ばれる微細加工ポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイスの個々のウェル内の固体培地上でワームを培養することを可能にする。各デバイスは、単一ウェルトレイ(すなわち、96ウェルプレートと同じ寸法)に配置され、ワームがウェル間を移動するのを防ぐために、嫌悪溶液で満たされた堀によって分離された240ウェルを有する。各ウェルは、その寿命の間、単一のワームを収容することができます。デバイスは吸水性ポリアクリルアミドゲルペレット(「水結晶」と呼ばれる)に囲まれており、トレイは湿度を維持し、メディアの乾燥を最小限に抑えるためにParafilmラボフィルムで密封されています。このシステムにより、個々の動物の健康寿命と寿命のデータを収集できますが、固体培地を使用すると、公開されたC.エレガンスの寿命研究の大部分で動物が経験した環境をよりよく再現できるため、より直接的な比較が可能になります。最近、PDMSデバイス16の代わりに、微小細胞毒性アッセイ15に元々使用されていたポリスチレンマイクロトレイを使用して同様の技術が開発された。マイクロトレイ法は、固体培地上で培養されたワームの個別化されたデータの収集を可能にし、典型的には逃げを引き起こす条件(例えば、ストレッサーまたは食事制限)の下でワームを収容する能力が向上し、トレードオフは、各マイクロトレイが96匹の動物しか収容できないというトレードオフである16、ここで使用されるマルチウェル装置は最大240匹の動物を収容することができる。
ここでは、プレート間の一貫性と複数のデバイスの並列調製に最適化されたマルチウェルデバイスを調製するための詳細なプロトコルを示します。このプロトコルは、Fang-Yen研究所13の元のプロトコルから採用されました。具体的には、汚染を最小限に抑え、固体培地と細菌の食物源の両方の一貫した乾燥を最適化し、RNAiと薬物を送達する技術の説明があります。このシステムは、個人の健康寿命、寿命、および体のサイズや形状などの他の表現型を追跡するために使用できます。これらのマルチウェルデバイスは、寿命を測定するための既存のハイスループットシステムと互換性があり、従来の寿命実験に伴う手作業の多くを排除し、個々の C.エレガンス における自動化された直接的な寿命測定と健康追跡の機会を大規模に提供します。
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Protocol
1.原液および培地の調製
注意: マルチウェルデバイスの準備を開始する前に、次のストック溶液と培地を準備してください。
- 線虫増殖培地(NGM)および低メルトNGM(lmNGM)用のストックソリューション:
- 1 M K 2 HPO 4の準備:1 Lボトルに174.18 gのK2HPO4を加え、滅菌脱イオン水で1 Lまで満たします。オートクレーブ(121°C、15psig)で30分間、室温(RT)で保存した。
- 1 M KPi、pH 6.0を準備します:1 Lボトルに136.09 gのKH2HPO4 を加え、滅菌脱イオン水で1 Lまで満たします。1 M K2HPO4 で滴定してpH 6.0にします。オートクレーブ(121°C、15psig)で30分間、RTで保存します。
- 1 M CaCl 2の調製:73.5 gのCaCl2を500 mLボトルに加え、500 mLまで滅菌脱イオン水で満たします。オートクレーブ(121°C、15psig)で30分間、RTで保存します。
- 1 M MgSO 4の準備:123.25 gのMgSO4を500 mLボトルに加え、滅菌脱イオン水で500 mLまで満たします。オートクレーブ(121°C、15psig)で30分間、RTで保存します。
- 5 mg / mLコレステロールを準備する:2.5 gのコレステロール、275 mLの100%エタノール、および25 mLの滅菌脱イオン水を500 mLの琥珀色のボトルに入れます。RTに保管してください。
- 50 mMフロクスウリジンの調製:0.1231 gのフロクスウリジンと10 mLの滅菌脱イオン水を15 mLのコニカルチューブに入れます。10 mLシリンジを使用して0.22 μmフィルターでフィルター滅菌します。10本の微量遠心チューブに1 mLずつ分注し、-20°Cで保存します。
- 50 mg / mLのカルベニシリンを調製する:15 mLのコニカルチューブで、500 mgのカルベニシリンと10 mLの滅菌脱イオン水を混ぜ合わせます。10 mLシリンジを使用して0.22 μmフィルターでフィルター滅菌します。10本の微量遠心チューブに1 mLずつ分注し、-20°Cで保存します。
- 1 mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を調製する:15 mLのコニカルチューブで、2.38 gのIPTGと10 mLの滅菌脱イオン水を混ぜ合わせます。10 mLシリンジを使用して0.22 μmフィルターでフィルター滅菌します。10本の微量遠心チューブに1 mLずつ分注し、-20°Cで保存します。
- 100 mg / mLのアンピシリンを調製する:15 mLのコニカルチューブで、1 gのアンピシリンと10 mLの滅菌脱イオン水を混ぜ合わせます。10 mLシリンジを使用して0.22 μmフィルターでフィルター滅菌します。10本の微量遠心チューブに1 mLずつ分注し、-20°Cで保存します。
- 一般的な C.エレガンス 維持のための線虫増殖培地(NGM)の調製
- 50枚のプレートを作るには、1Lフラスコにバクト寒天10g、NaCl1.5g、バクトペプトン1.25g、超純水486mLを混ぜ合わせます。オートクレーブを液体サイクル(121°C、15psig)で少なくとも30分間滅菌します。
- オートクレーブ後、培地を55°Cに冷却した後、1 M KPiを12.5 mL、1 M MgSO4を500 μL、1 M CaCl2を500 μL、および5 mg/mLコレステロールを500 μL加えます。
- 滅菌技術を使用して、各60 mmプレートに10 mLの培地を注ぎます(合計50)。培地が固まった後(注ぎ込み後少なくとも30分)、プレートの中央に一晩増殖させた細菌培養物(ステップ4およびステップ10に従って調製)300 μLをピペットで貼り付けます。プレートをベンチに置いて、細菌培養物を乾燥させて厚くします(1〜2日)。プレートは4°Cで保管してください。
- 低融解線虫増殖培地(lmNGM)プレ混合物を調製します。
- 500 mLフラスコに、4 gの低融点アガロース、0.5 gのバクトペプトン、および195 mLの超純水を混ぜ合わせます。オートクレーブを液体サイクル(121°C、15psig)で少なくとも30分間滅菌します。
- 培地がまだ溶融している間に、10 mLのアリコートを滅菌ガラス試験管に分配します。各試験管をパラフィルムで密封し、続いて試験管キャップを付けて、lmNGMプレ混合物を保存し、乾燥を防ぎます。培地は固化し、使用前にRTで~2週間保存できます。
- 142.8 mM NaClを調製する:250 mLのボトルに、0.8345 gのNaClと100 mLの滅菌脱イオン水を混ぜ合わせます。オートクレーブ(121°C、15psig)で30分間、RTで保存します。
- 洗剤溶液を準備する:15 mLのコニカルチューブで、3 mLのTween 20と7 mLの滅菌脱イオン水を混ぜ合わせます。十分に混合し、10 mLシリンジを使用して0.22 μmフィルターでフィルター滅菌し、RTで保存します。
- 硫酸銅溶液を調製する:滅菌済みの50 mLボトルで、20 mLの滅菌脱イオン水、0.5 gのCuSO4、および100 μLの洗剤溶液(ステップ1.5で調製)を混ぜ合わせます。CuSO4 が溶解するまで混合します。RTに保管してください。
- 吸水性ポリアクリルアミド結晶の準備:オートクレーブで安全なスクイーズボトルに、150 mLの脱イオン水と1 gのタイプS高吸水性樹脂を混ぜ合わせます。ボトルを数回ひっくり返して穏やかに混ぜます。オートクレーブを液体サイクル(121°C、15psig)で少なくとも20分間行い、RTで保存します。
- リソジェニーブロス(LB)を準備する:1 L以上のビーカーで、20 gのLB粉末を1 Lの脱イオン水と混ぜ合わせます。2つの500mLビーカーに分注します。オートクレーブ(121°C、15psig)で30分間、RTで保存
- 溶解性ブロス(LB)寒天プレートを準備します。
- 1 Lフラスコに、10 gのLB粉末、7.5 gのバクト寒天培地、および500 mLの脱イオン水を混ぜ合わせます。液体サイクル(121°C、15psig)で30分間オートクレーブします。
- 必要に応じて、オプションの抗生物質(オートクレーブ後、培地が55°Cに冷却された後):500 μLの100 mg/mLアンピシリンを追加します。滅菌技術を使用して、各100 mmプレート(合計25)に20 mLの培地を注ぎ、4°Cで保存します。
2. 3Dマルチウェルデバイス金型の印刷
注: 各デバイスは、カスタム 3D プリント金型を使用して PDMS から成形されます。1つの金型で必要な数のデバイスを製造できます。ただし、複数のデバイスを同時に準備しようとする場合は、各デバイスを並行して作成するために1つの3Dプリントされた金型が必要です。
- STL ファイルをダウンロードします (補足ファイル 1 を参照)。
- 高解像度3Dプリンターで金型を印刷します。
メモ: プリンタの解像度は、井戸と堀の容積を一定にするために十分に高くなければなりません。推奨されるプリンタ解像度は、最小 XY 解像度 ~40 μm、レイヤー解像度 28 μm です。多くの材料タイプがPDMSの硬化を妨げるため、3Dプリンターで使用される材料も同様に重要です。経験から、Vero Black印刷材料を使用して高解像度のPolyJetプリンター(解像度:X軸= 600 dpi、Y軸= 600 dpi、Z軸= 1,600 dpi)で製造された金型は一貫して機能します。この研究で使用された金型の3D印刷は外部委託されました(印刷の詳細は 材料表に記載されています)。
3.マルチウェル装置の準備
注:このセクションでは、3Dプリントされた金型を使用してPDMSマルチウェルデバイスを作成する方法について説明します。
- 予熱できるように、硬化オーブンを55°Cに設定します。
- 1 つのバッチで準備するデバイスの数を決定します。デバイスごとに、使い捨てヘラを使用して、60 gのPDMSベースと6 gの硬化剤を大型の使い捨て計量ボート(または同様の使い捨て容器)で混合します。
- PDMS混合物を真空チャンバーに-0.08MPaで30分間入れて気泡を除去します。
- PDMS混合物を各3Dプリント型に注ぎます。PDMS混合物が金型の上部からわずかに上に伸びるように、金型を完全に充填します。こぼれた場合に備えて、余分なPDMS混合物を金型に補充するために保管してください。
- 充填した金型と余分なPDMS混合物を真空チャンバーに-0.08MPaで25分間入れて、注入プロセス中に発生した気泡を取り除きます。
- 充填された金型を真空チャンバーから取り出し、使い捨てヘラで残っている気泡をポップします。スパチュラを使用して、目に見える破片や残っている気泡を金型の端までブラッシングして、ウェルから離します。破片や気泡が残っていると、後の手順でイメージングが妨げられる可能性があります。
- 金型がPDMS混合物で完全に満たされていることを確認してください。混合物のごく一部が真空チャンバー内または移送中にこぼれるのが一般的です。ステップ3.5で脱気した余分なPDMS混合物を使用して補充します。これは泡を作成するべきではありませんが、泡が発生した場合は、へらで型の横にそっとブラシをかけることができます。
- 最初に一方の端を置き、アクリルが金型の上に平らになるまでもう一方の端をゆっくりと下げて、端より上に伸びているPDMS混合物を移動させて、PDMSで満たされた金型の上に平らなアクリルシートを置きます。アクリルシートの配置中に気泡が発生した場合は、アクリルをゆっくりと取り外し、必要に応じて金型にPDMS混合物を補充し、アクリルの配置を再開します。アクリルシートは、成形装置用の平らな底部を形成し、すべてのウェルがベースに対して同じレベルにあることを確認します。
- アクリルの上に2.5ポンドの重りを置きます。それぞれが別々のアクリルシートを備えた複数の金型を積み重ねることができます。加重型をオーブンに入れ、55°Cで一晩硬化させます。
- 翌日、オーブンから重りと型を取り出します。
- アクリルと硬化PDMSの間にかみそりの刃を慎重に動かして、シールを破ります。金型の上部からアクリルを慎重に取り外します。PDMSはこの時点で設定されており、アクリルを取り除くにはある程度の力がかかる可能性があります。
- かみそりまたは金属ヘラを使用して、硬化したPDMSの側面を金型から慎重に緩めます。この段階でPDMSを引き裂くのは簡単です。端の周りをゆっくりと穏やかに作業して、PDMSデバイスを無傷で取り外します。
注意: 印刷したばかりの金型は、最初の3回の使用で特に粘着性があり、デバイスを取り外しようとしているときにPDMSが裂けることがよくあります。より多くの用途で、硬化したPDMSを金型から取り外すことが容易になります。 - デバイスをアルミホイルで包み、オートクレーブテープで密封します。オートクレーブをドライサイクルで121°C、15psigで少なくとも15分間滅菌する。オートクレーブ後、包んだデバイスをベンチに保管し、必要に応じて使用します。
4.バクテリアを縞模様にする
注意: ワームがマルチウェルデバイス上にある間に、ワームの食料源として使用されるバクテリアの準備を開始します。最も一般的な細菌は、 大腸菌 株OP50(またはRNAi実験用のHT115株)です。ワームをデバイスに追加する少なくとも 2 日前に、この手順を完了してください。
- バクテリアを新鮮なLBプレートにストリークします。菌株特異的な選択的添加物(例えば、細菌にアンピシリン耐性を付与するプラスミドを選択するためのアンピシリン)がLBプレートに含まれていることを確認してください。
- プレートを37°Cで一晩(~18時間)インキュベートし、コロニーを成長させます。
5.培地ローディング用のマルチウェル装置の準備
注意: デバイスを構成するシリコーンPDMS材料の表面は疎水性であり、少量の井戸と嫌悪堀がそれぞれNGMと硫酸銅で満たされるのを防ぎます。この問題を回避するために、酸素プラズマを使用して、デバイスの表面特性を一時的に親水性に変更し、限られた時間枠(最大~2時間)内に井戸と堀を充填できるようにします。このセクションでは、プラズマ洗浄プロセスを完了するための手順について説明します。プラズマクリーンの長引く効果がスポッティングを妨げる可能性があるため、デバイスウェルにバクテリアを見つける少なくとも1日前に、このステップを完了してください。セクション5〜7のタイミングを考えると、技術者あたりのこれらのステップの実際の制限は、並列に3つのデバイスです。
- セクション6の準備として、ドライビーズバスインキュベーターを90°Cに予熱します。
- マルチウェルデバイスのウェルを充填するために必要な総培地量は、ペトリプレートの場合に比べて小さいため、NGMのバッチを大量に調製し、それを試験管に分注します(ステップ1.3を参照)。
注:メディアのチューブはベンチに~2週間保管できるため、これは事前に行うことができます。培地を調製し、チューブに分注した場合は、手順5.3に進みます。 - 手袋を着用した状態で、オートクレーブ滅菌されたマルチウェルデバイスの包装を解きます。ウェルには触れないでください。デバイスの右上隅にある小さな切り込みを切り取って、使用/再利用された回数を示します(各デバイスのクリーニングと再利用の手順と推奨事項については、以下のセクション15を参照してください)。
- ウェルを上に向けて、最大3つの包装されていないデバイスをプラズマクリーナーに入れます。プラズマクリーナーを実行します。
注意: 次の詳細な手順は、プラズマエッチングPE-50プラズマクリーナー用です。特定の手順と設定は、他のプラズマクリーナーに適合させ、場合によっては再最適化する必要があります。- プラズマクリーナーの電力レベルが75%に設定されていることを確認してください。
- ベントバルブとアイソレーションバルブの両方が オフ の位置にあることを確認します。
- 酸素タンクのメインバルブを開きます。レギュレーターの圧力が15 psigから20 psigに低下するまで待ってから、アイソレーションバルブを オン の位置に回します。
- 真空ポンプとプラズマクリーナーの電源を入れます。
- プラズマクリーナーに次の設定を入力するか(最初の使用)、以前にプログラムした設定が正しいことを確認します。
プラズマ時間:3:00分
真空セットポイント:149.5 mTorr
大気ベント:45秒
パージベント:5秒
ガス安定化:15秒
真空アラーム:3:00分
オートサイクルオフ:オン - Enter キーを押して [コマンド] メニューに移動します。右方向キーを使用して [セットアップ メニュー] を選択し、Enter キーを押します。Enterキーを押して現在の各設定を確認し、右矢印キーを押して次の設定に移動して、すべての設定をスクロールします。
- コマンドメニューに戻るには、上矢印を押してから左矢印を押します。
- [コマンド メニュー] 画面で、Enter キーを押します。選択 コマンド プラズマ を押して 入力します.システムは、次のフェーズを循環します。
プラズマポンプダウン
ガス安定化:このフェーズでは、流量計が1cc / minになるまでプラズマクリーナーの ガス10 ノブを調整します。
プラズマ時間
パージポンプダウン
プラズマサイクル完了
チャンバーベント
注意: このプロセスは、完了するまでに約5〜10分かかります。すべてのフェーズが完了すると、 コマンドメニュー が再び画面に表示されます。プラズマ ポンプダウン フェーズ中に圧力が十分に低下しない場合、プラズマクリーナーは次のフェーズに進まず、画面にエラーメッセージが表示されます。このような場合は、真空ポンプのオイルを確認してください。オイルレベルが低い場合、またはオイルが濁っている/汚れている場合は、オイルを交換すると、真空圧が必要なレベルに達することができます。 - 酸素タンクのメインバルブをオフにします。
- 非常にゆっくりと、ベントバルブを オン の位置に回し、酸素タンクのレギュレーター圧力をゼロに戻します。
- アイソレーションバルブを オフ の位置に回します。
- 真空ポンプとプラズマクリーナーの電源を切ります。
注:プラズマクリーナーによるマルチウェルデバイスの親水性表面改質は一時的なものであり、時間の経過とともに(最大約2時間)徐々に効果が低下します。セクション6とセクション7をできるだけ早く進めてください。
6. ウェルにlmNGMを充填する
注意: ドライビーズバスインキュベーターをオンにして、ステップ5.1から予熱する必要があります。浴槽が90°Cに達していることを確認してください。
- トレイの内側に70%エタノールをスプレーし、タスクワイプで拭いて乾かすことにより、デバイスごとに1つのシングルウェルポリスチレントレイを滅菌します。
- 手袋をはめた手でプラズマクリーナーから各デバイスを取り出し、クリーニングしたトレイに置きます。
- 25 mLの使い捨てピペット洗面器を90°Cに加熱した後、ビーズバスインキュベーターに入れます。
- 充填するデバイスごとに、固化したlmNGMプレ混合物のチューブを1本集めます(ステップ1.3を参照)。
- lmNGMプレミックス試験管を200 mLガラスビーカーに入れ、キャップとパラフィルムを取り外します。メディアが注ぐのに十分溶けるまで、~20秒間マイクロ波をかけます(この段階では、固体メディアの存在は問題ありません)。
- 複数の試験管からの溶融lmNGMプレ混合物を別の滅菌200 mLビーカーに混ぜ合わせます。さらに20秒間電子レンジを続けて、合計40秒に達します。lmNGMプレ混合物が沸騰し始めたら、電子レンジを停止し、lmNGMプレ混合物を沈降させてから続行します。
- 溶融したlmNGMプレ混合物を電子レンジから取り出し、~60°Cまで冷却します。
メモ: この段階では、メディアは冷却され、~5 分後に再固化します。すぐに手順 6.8 と手順 6.9 に進みます。 - lmNGMプレミックス10 mLごとに、250 μLの1 M KPi、1 M MgSO4の10 μL、1 M CaCl2の10 μL、および5 mg/mLコレステロール10 μLを(順番に)加えます。
- 装置で成虫を監視するときに卵の孵化を防ぐために、10μLの50mMフロクスウリジンを追加します。
- RNAiプラスミドを選択し、RNAの発現を誘導するには、50 mg/mLのカルベニシリン5 μLと1 mM IPTGの12 μLを追加します。
注:抗生物質またはその他の添加剤は、実験の設計に応じて変更することができます。この段階で、試験化合物/薬物を培地に追加することもできます。
- 溶融したlmNGMをビーズバスの25 mL洗面器に注ぎます。
- 200 μLのマルチチャンネルリピーターピペットを使用して、デバイスウェルにlmNGMを充填します。
- 14 μLの分注になるようにリピーターを設定します(200 μLのピペットチップを使用する場合は、14 μLを最大14回分注できます)。
- 5つのピペットチップを取り付けます。デバイスのウェルの間隔は、384ウェルプレートと同じです。標準的なマルチチャンネルピペットは、ユーザーが行/列の他のすべてのウェルにピペットで入れることができるように間隔を空けています。
- チップに溶融lmNGMをロードします。最初の14 μLをlmNGM含有洗面器に戻します。
- 迅速かつ慎重に、14 μLを内側のウェル(図1Bの白)に分注し、 図1Bの「x」でマークされたものから始めて、プレートを横切って右に移動し、次に下に移動し、合計 12 回分注します(60ウェル)。
- 残りのlmNGMは、最終的な分注液が通常14 μL未満であるため、洗面器に戻します。
- すべての内側のウェルが満たされるまで、手順6.10.3〜6.10.5を繰り返します。
- 次に、15 μLのアリコートを分注するようにリピーターを設定します。 手順6.10.3〜6.10.5を繰り返しますが、内側のウェルの代わりに、図 1Bの「+」でマークされたウェルから始めて、プレートの外縁の周りを移動して、ウェルの最も外側のリング( 図1B の灰色)を満たします。
注意: 培地がピペットチップで固まらないように、すばやく作業してください。lmNGMを堀にこぼさないでください。外側の井戸はより早く乾く傾向があります。1 μLのlmNGMを追加すると、最終乾燥ウェルの表面を内側のウェルと同じ乾燥時間で水平にすることができます。
- 品質管理ステップとして、各ウェルを調べて、アンダーフィル(lmNGM表面がウェルの端の下に沈んでいる)、オーバーフィル(lmNGM表面の上部にドーム型がある)、気泡や破片が含まれているウェルなど、イメージングを妨げる可能性のある欠陥があるウェルを特定します。
- 固化したlmNGMを、短い白金ワイヤーピックまたは真空アスピレーターで不十分なウェルから取り除きます。空のウェルに新鮮な溶融lmNGMを補充します。また、短いプラチナワイヤーピックまたは真空吸引器で堀に溢れた媒体を取り除きます。
7.堀に硫酸銅を加える
注意: このデバイスの井戸は連続した堀に囲まれています。ここでは、堀は硫酸銅で満たされており、硫酸銅は忌避剤として機能し、ワームが井戸から逃げるのを防ぎます。
- 200 μLのピペットを使用して、200 μLの硫酸銅溶液(ステップ1.6を参照)を各コーナーのデバイスの堀に2回ずつ分注します。これは、硫酸銅が堀全体を流れるのに十分な量でなければなりません。どの時点でも堀を埋めすぎないように注意してください。硫酸銅はウェルの上面に触れてはいけません。
- 硫酸銅が堀全体を簡単に流れない場合は、短いプラチナワイヤーピックを使用して張力を破り、硫酸銅を堀に引きずり込みます。
- 硫酸銅が堀全体を流れた後、200μLのピペットまたは真空吸引を使用して、堀からできるだけ多くの硫酸銅を取り除きます。残された残留物は、ワームが井戸を離れるのを防ぐのに十分です。硫酸銅溶液でいっぱいの堀を離れると、硫酸銅が井戸にこぼれ、ワームが逃げる危険性があります。
8.オートクレーブ水結晶の追加
注意: プレート内の湿度を維持し、lmNGMの乾燥を防ぐために、各デバイスは飽和吸水性ポリアクリルアミド結晶で囲まれています。
- 水の結晶を準備します(手順1.7を参照)。
- スクイーズボトルを使用して、デバイスとトレイの壁の間のスペースに水の結晶を追加します。トレイの蓋を閉め、パラフィルムで四方を包みます。パラフィルムを2枚追加して、プレートを完全に密閉します。
注:水の結晶はビーカーで準備し、滅菌したヘラでトレイにすくうことができます。ただし、これにより手順に時間がかかり、各トレイが開いて潜在的な汚染物質にさらされる時間が長くなります。 - 細菌が発見される準備ができた翌日まで、密封された装置をベンチに置いておきます。lmNGMが追加された後、デバイスがウェルを上に向けて保管されていることを確認します。
9.年齢同期ワーム集団の準備
注:次の手順では、4番目の幼虫期(L4)でマルチウェルデバイスに追加する準備ができているワームの同期された集団が生成されます。ただし、開発のさまざまな段階にあるワームを追加することもできます。この手順は、L4 が必要な場合は、ワームをデバイスに追加する 2 日前に完了する必要があります。希望するライフステージに合わせて同期のタイミングを調整します。
- 一貫した老化研究のために、 C.エレガンスを 標準的なNGMプレート上に維持します(十分に給餌された条件下で20°Cでステップ1.2を参照)。
- 標準的な方法、例えば漂白17または時限産卵1を介してストックプレートから動物の同期集団を得る。
- 分離した卵をバクテリアで斑点を付けたNGMプレートに追加します。卵はこのプレートで孵化し、ワームは野生型動物の場合2日でL4幼虫期に達します。
10.細菌培養物への接種
注:細菌は、 C.エレガンス、最も一般的には 大腸菌 株OP50またはHT115の主要な食料源として使用されます。細菌は10倍濃縮されており、これは調製された培養物の量に含まれるべきである。デバイスを見つける前日に細菌培養を準備します。
- ステップ4で調製したLBプレートから、単一のコロニーを選び、スポットするデバイスごとに12mLの滅菌LBを接種します。使用される細菌株に対して必要に応じて選択剤を含める。
- 細菌培養物を37°Cのインキュベーターで一晩(~18時間)増殖させ、~250rpmで振とうします。
11.濃縮されたバクテリアで井戸を見つける
注:少量の濃縮細菌が各ウェルに追加され、デバイス上の寿命全体にわたってワームに餌を与えるのに十分です。ワームをウェルに加える前に、細菌培養物を乾燥させる必要があります。各ウェルの培地容量は、添加した細菌量(5 μL)に比べて小さい(14〜15 μL)ため、細菌培地の化学物質含有量はウェルの化学環境に影響を与える可能性があります。これを説明するために、細菌を濃縮して塩水に再懸濁し、低浸透圧ストレスを回避しながら枯渇したLBを除去します。この段階で追加されるlmNGMレシピ(ステップ1.3〜1.4を参照)に塩は追加されません。
- セクション10に記載されるように細菌を一晩増殖させた後、細菌培養物を10倍濃縮する。細菌を~3,400 x g で20分間遠心分離してペレット化し、上清を処分し、ペレットを元の培養容量の1/10の142.8 mM NaClに再懸濁します(ステップ1.4を参照)。例えば、1つの240ウェルデバイスを見つけるには、12 mLの培養液をスピンダウンし、1.2 mLの142.8 mM NaClに再懸濁します。
注:テスト化合物/薬物は、スポッティングする前に再懸濁された細菌培養物に追加できます。 - リピートピペットを使用して、5 μLの濃縮細菌を各ウェルにスポットします。ピペットチップがlmNGMを突き刺し、ワームがウェルの表面の下に穴を掘る可能性があるため、lmNGM表面との直接接触を避けてください。虫が堀に引き寄せられて堀に逃げてしまうので、菌が堀にこぼれないように注意してください。
- トレイの蓋を外した状態で斑点のあるバクテリアを乾かします。このステップは、井戸環境の長期的な完全性にとって重要であり、斑点を付けられたデバイスを乾燥させるさまざまな方法があります。どの方法を使用する場合でも、バクテリアが乾いている間はカバーを外して座る必要があるため、デバイスが無菌環境にとどまっていることを確認してください。風量の増加により、乾燥時間が大幅に短縮されます。乾燥は、以下の手順で説明するように実行できます。
- デバイスを覆い隠さずに、10%の漂白剤で洗浄したプラスチックビンなどの清潔で密閉された容器に置き、続いて70%のエタノールを入れます。この乾燥方法は数時間かかることがあります。
- カバーされていないデバイスを滅菌層流フードに入れます(以下の推奨方法と同様)。
- コンピュータケースファンとHEPAフィルターを使用して最小限のコストで構築できる特注の「乾燥ボックス」(この研究で採用された最適化された方法)を使用してデバイスを乾燥させます( 補足ファイル1を参照)。
注:使用する方法に関係なく、乾燥ステップはローカル環境に合わせて最適化する必要があります。通常の乾燥時間が特定されるまで、ウェルの乾燥速度を頻繁に監視します。低湿度環境では、乾燥ボックスを使用すると、乾燥時間は~30〜40分になります。ウェル内の培地が収縮して沈むため、プレートを乾燥させすぎないでください。デバイスをより長く乾燥させ、多数のウェルを過剰に乾燥させるよりも、いくつかのウェルがまだ濡れている間にデバイスを乾燥から取り外す方が良いです。
- 水の結晶を確認してください。トレイ内の水の結晶の大部分が乾燥し、乾燥プロセス中に体積が失われた場合は、トレイにさらに追加します。
- バクテリアが乾いたら、すぐにワームを追加するか(セクション12)、後で使用するためにトレイを密封します。密封するには、トレイの蓋を閉め、4つの側面すべてを1枚のパラフィルムで包みます。2 回繰り返して、合計 3 つのパラフィルムレイヤーを作成します。トレイを完全に包んだ後、ワームを追加する前に、デバイスを室温で最大4日間ベンチに置いておくことができます(セクション12)。
12.マルチウェルデバイスへのワームの追加
- プラチナピックを使用してウェルごとに1つのワームを手動で各ウェルに追加し、セクション9で準備したワームのプレートから動物を移します。希望するライフステージと年齢にあるワームのみを選択してください。
注:ワームをデバイスに追加するのに1時間以上かかると、lmNGMが乾燥する可能性があるため、ワームはできるだけ早く追加する必要があります。デバイスのウェルに追加する前に、一度に複数のワーム(20+)を選択すると、速度を上げるのに役立ちます。
13.長期使用のためのデバイスの準備の終了
注意: これらの手順により、実験期間中、デバイスのウェルが水和されたままになります。
- 水の結晶を調べます。水の結晶がデバイスの上部と同じ高さであるが、オーバーフローしていないことを確認してください。必要に応じて、トレイに水の結晶を追加します。
- 準備した洗剤溶液をトレイの蓋の内側に一滴加え(手順1.5を参照)、洗剤溶液が乾くまでタスクワイプでこすります。これにより、デバイスがトレイ内に密封された後の蓋の曇りを防ぎ、ワームがはっきりと見えるようになります。
- パラフィルムシールの長期的な完全性を促進する特定の技術を使用して、トレイを3枚のパラフィルムで包みます。
- トレイの両側だけを覆うようにパラフィルムを少し伸ばします。これを2番目のパラフィルムで繰り返して、他の2つの側面をカバーします。
- パラフィルムの最初の層の上に重ねて、パラフィルムの最後の部分を取り、それを完全に伸ばし、4つの側面すべてを包みます。適切に密封されている場合、デバイスウェルは~2か月間水和したままにする必要があります。
注意: パラフィルムの完全性は1〜2週間ごとに監視する必要があり、壊れた場合はパラフィルムを交換する必要があります。
- 70%エタノールで濡らしたタスクワイプを使用して、トレイの上部から指紋を取り除きます。
14. データの収集
注:この研究の目的は、培養方法論を説明することです。一度装着されると、マルチウェルデバイスは、さまざまな表現型の縦方向モニタリングと互換性があります。ここでは、最も一般的なパラメータのいくつかを測定するための基本的なガイダンスが提供されます。
- 寿命:プレートをタップするか、1〜3日ごとにワームを明るい青色の光にさらして、寿命を監視します。動きが観察されない場合は、デッドとしてスコアを付けます。これらのマルチウェルデバイスは、寿命を推定するための自動イメージングおよび分析パイプラインとも互換性があります13,18。
- 活動:デバイスウェル内の動物の静止画像またはビデオを撮影し、移動距離、速度、またはその他の移動メトリックを評価することにより、生涯を通じて個々の動物の活動を監視します。これらのデバイスは、活動を推定するための自動イメージングおよび分析パイプラインとも互換性があります13,18。
- 体のサイズと形状:デバイスウェル内の動物の静止画像を撮影し、標準的なイメージング技術を使用して視覚パラメータを定量化することにより、体のサイズと形状の変化を監視します。原則として、この培養方法は、線虫の体型のより高度な評価のために既存のソフトウェアと互換性があるはずです19,20,21。
15.デバイスの再利用
注意: 実験が完了した後、マルチウェルデバイスは洗浄して最大3回再利用できます。追加の再利用は、おそらく培地からの化学物質またはPDMS材料の壁に蓄積する細菌によって引き起こされる、ワームの表現型に影響を与え始めます。
- パラフィルムを廃棄し、トレイからデバイスを取り外します。デバイスの右上隅にあるノッチを確認します。これは、デバイスが使用された回数を示しています。3回使用した場合は、デバイスを廃棄してください。使用回数が3回未満の場合は、清掃して再利用してください。
注意: トレイはポリスチレン製で、lmNGM、バクテリア、またはメディアへの添加剤と直接接触することはありません。視覚的に明確である限り、何度も再利用できます。 - トレイから残っている水の結晶を洗い流します。トレイの内側に10%漂白剤溶液をスプレーし、10分間放置します。脱イオン水ですすぎ、すぐに乾かしてウォータースポットを避けてください。
- デバイスを流水の下に保持して、ウェルからメディアのクリーニングを開始します。デバイスを水中でゆっくりと曲げたりひねったりして、ウェルからメディアを緩めますが、デバイスが裂けるほど曲げないでください。ウェルに詰まった残りの培地を200 μLのピペットチップで取り出します。
- 2Lビーカーに攪拌子~3/4を入れ、脱イオン水で沸騰させます。
- 沸騰したお湯に1つまたは2つのマルチウェルデバイスと攪拌子を追加します。磁気攪拌を低速(~200 rpm)にオンにして、水中でデバイスを穏やかに攪拌します。デバイスを10分間沸騰させます。
- 金属製のピンセットでデバイスを水から取り出し、ペーパータオルの上にしっかりと下に置いて水気を切ります。デバイスを少なくとも一晩乾燥させます。
- 装置が完全に乾いたら、ホイルで包み、オートクレーブテープで密封します。オートクレーブテープに装置の使用回数を記入してください。オートクレーブを121°Cで15分間のドライサイクルで滅菌します。これで、デバイスを再利用する準備が整いました。
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Representative Results
WorMotel培養システムを使用して、寿命、健康寿命、活動など、さまざまなデータを収集できます。発表された研究では、寿命と健康寿命13,14、静止と睡眠22,23,24、および行動25を研究するためにマルチウェルデバイスを利用しています。寿命は、手動で、または画像の収集とダウンストリームの画像分析を通じてスコアリングできます。前者のアプローチでは、1〜3日ごとに刺激(プレートを叩いたり、青色光にさらされたりするなど)に続いてワームを手動で観察し、ペトリプレート1の標準的な方法と同様に、動きが観察されない場合は死んでいるとスコアを付けることができます。後者のアプローチは似ていますが、刺激が適用された後に撮影された画像間のフレーム間の違いを比較することによってワームの動きを決定できることが異なります。これは、運動がその時点での個々の動物の活動レベルに関する情報を提供し、寿命(例えば、運動の停止)および健康寿命(複数の定義が提案されている)を決定することができる指標を提供するという点で追加の利点を提供する。画像はさらに、体の大きさ、体型、体の姿勢などの追加の生理学的パラメータを抽出するために使用することができる。
システムの能力を実証するために、個々の動物の寿命、健康寿命、および日常活動の文脈で、daf-2遺伝子によってコードされるインスリン受容体とdaf-16によってコードされる下流のFOXOファミリー転写因子との間の古典的なエピスタティック関係を調べました。野生型(株N2)およびdaf-16(mu68)機能喪失(株CF1038)のいずれかを発現する大腸菌(株HT115)を給餌したC.エレガンス(空のベクター;EV)またはdaf-2 RNAi給餌コンストラクトをマルチウェル装置で培養し、各動物の寿命(図2A)、健康寿命(図2B)、および毎日の活動(図2C)についてモニタリングした。活動は、5秒ごとに2分間一連の静止画像を撮影することによって毎日監視され、ワームは活動を刺激するために1分間5秒間明るい青色光にさらされました(Churginら13による)。各動物の毎日の活動は、ウェルと画像全体のバックグラウンドを正規化し、各画像でワーム領域を特定し、隣接する画像間の面積の変化を計算することによって推定されました。寿命は、各ワームの活動が最後に観察された年齢として定義され、ヘルススパンは、ワームが全身の長さを動かせなくなった年齢として定義されました。多くの先行研究(例えば、Kenyon et al.26、Murphy et al.27)から予想されるように、daf-16(mu86)変異は寿命を短くし、daf-2のRNAiノックダウンによる寿命延長を妨げました(図2A)。ヘルススパンについても同様のパターンが観察されました(図2B)。マルチウェル装置培養システムを使用する利点として、生涯を通じて個々の動物を追跡する能力により、集団全体で測定された各表現型の個体変動の詳細な分析が可能になります。たとえば、個々の動物の寿命と健康寿命の変動は、絶対的な用語(図2D)または全寿命の一部(図2E)として比較できます。幼少期の表現型は、集団全体の個々の動物において、寿命を含む晩年の表現型とさらに比較することができる。例えば、測定されたすべての条件において、寿命全体にわたる個々の動物の累積活動(すなわち、個々の活動の曲線下面積[AUC])は、寿命の5日目までの累積寿命(図2G)よりも寿命(図2F)とよりよく相関した。この作業の目的は、デバイスを使用して特定の表現型を測定するためではなく、個々の動物を経時的に追跡するためのマルチウェル環境を構築するための詳細なプロトコルを提供することであることを強調します。図2に示す代表的な結果は、このシステムで測定できる表現型のほんの一例です。一旦構築されると、マルチウェル環境は、固体培地上のフリークロールワームの表現型を測定するための幅広い技術と互換性があります。
図1:微細加工されたマルチウェルデバイスの概略図 。 (A)個々の C.エレガンスは 、個々のウェルにバクテリアフードを播種した固体低融解線虫増殖培地(lmNGM)アガロースパッド上で培養されます。ウェル間のスペースは、ウェル内の各ワームを分離するために嫌悪化学物質(硫酸銅)でコーティングされています。各デバイスは、シングルウェルトレイ内に固定されています。トレイの周囲は、湿度を維持するために水の結晶で満たされています。トレイはパラフィルムで密封されており、酸素交換が可能です。BioRender.com で作成された画像。(B)ウェルをロードするための推奨順序を示すマルチウェルデバイスの概要。内側のウェル(白色)には14 μLのlmNGMが入ります。外側のウェル(灰色)には15 μLのlmNGMが投与されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マルチウェルデバイスを使用した個々の動物の集団間で測定された表現型の相関。すべてのパネルは、空のベクターEV(RNAi)に投与された野生型(N2)動物(N = 138)、daf-2(RNAi)に投与された野生型動物(N = 151)、EV(RNAi)に投与されたdaf-16(mu86)動物(N = 123)、およびdaf-2(RNAi)に投与されたdaf-16(mu86)動物(N = 135)の4つの動物群を比較した同じ実験のデータを提供します。(A)daf-2(RNAi)からの寿命延長は、daf-16(mu86)ヌル変異によってブロックされています。ログランク検定によって決定されるグループ間のペアワイズ有意性(Rのsurvdiff関数)。(B)動物がdaf-2(RNAi)から全身の長さの延長を動かせなくなる日としてここで定義されている健康寿命は、daf-16(mu86)ヌル変異によってブロックされます。ログランク検定によって決定されるグループ間のペアワイズ有意性(Rのsurvdiff関数)。(C)生涯にわたる活動の3日間の移動平均は、daf-16(mu86)とdaf-2(RNAi)の両方によって減少します。群間の個々の動物の寿命にわたる活動の曲線下面積を比較するためにMann-Whitney U検定によって計算された有意性。(D)絶対値(平均±平均の標準誤差)としての各母集団の健康寿命と寿命。(E)各集団の健康寿命と寿命を各グループ内の総寿命に正規化したもの(平均±平均の標準誤差)。(F)個々の動物の生涯にわたる累積活動(寿命にわたる曲線下面積[AUC])は、線形回帰(Rのlm関数)によって計算された、(G)生涯にわたる特定の日における個々の動物の活動(平均活動が最大になるポイントを表す8日目の活動相関が示されている)よりも寿命とよく相関する。n.s. = 有意でない, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. すべてのp値は、各パネル内で行われた比較のためにボンフェローニ法を使用して多重比較のために調整されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:3Dマルチウェルデバイス金型を印刷するためのSTLファイル このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
WorMotelシステムは、何百もの孤立した C.エレガンスの 個別化されたデータを経時的に収集するための強力なツールです。発生停止、運動行動、および老化のアプリケーションにマルチウェルデバイスを使用した以前の研究に続いて、この作業の目標は、活動、健康、および寿命をより高いスループットの方法で長期間監視するためのマルチウェルデバイスの準備を最適化することでした。この作業は、元のプロトコル13からのステップの多くを最適化し、技術的困難を提示し得る重要なポイントを強調し、プレートおよび他の材料の再利用に関する議論を提供する、マルチウェルデバイスを準備するための詳細なプロトコルを提供する。
スケーリングの目的で、現在、通常の週に10〜20台のデバイスを準備しているラボとして、デバイスを再利用できるかどうか、再利用できる場合はどの程度再利用できるかが最重要でした。PDMS装置の準備は、ペトリプレート上で伝統培養を行うよりも時間と費用の両面で高いコストがかかりますが、これらの高いコストは、PDMSまたはシステムの他のコンポーネントを再利用することによって削減できます。多くの再利用により、PDMSは黄色の着色を発達させ始めましたが、これはおそらくlmNGM培地または細菌からの化合物の蓄積を反映しています。これらのプレートで培養された動物はまた、より高い逃げ率と寿命の短縮を示しました。数十の実験に基づいて、これらのPDMSデバイスを再利用するには3つの用途が最適であり、PDMSの劣化による測定可能な影響なしに加齢に伴う表現型を評価すると同時に、成形する必要のある新しいデバイスの数を減らすことができます(したがってコストを節約します)。さらに、1回目、2回目、3回目の使用でデバイスで成長させた実験マッチ動物は、ほとんど区別できず、統計的に異なる生存曲線を生成することを確認しました(データは示されていません)。デバイスを収容するために使用されるトレイはポリスチレン製であり、ワームの視覚化を妨げる可能性のある引っかき傷やその他のマークがない場合は、無期限に洗浄して再利用できます。
~2週間以上続くアプリケーション用のマルチウェルデバイスを準備するための重要な課題は、環境細菌や真菌によるプレート汚染の防止です。汚染を防ぐために滅菌が重要である複数のステップがあります。これらには、使用前のすべてのデバイスのオートクレーブ、再利用を目的としたデバイスの沸騰、湿度を維持するために使用される吸収水結晶のオートクレーブ、使用前に漂白剤とエタノールの両方を含むトレイのクリーニング、および曇りを防ぐためにトレイの蓋に塗布され、硫酸銅溶液に添加される洗剤溶液をフィルター滅菌することが含まれます。これらの変更のそれぞれを実装すると、汚染イベントが大幅に減少し、密閉されたデバイスを、>45日間の監視を必要とする長寿条件( daf-2のノックアウトなど)の下でも、寿命全体にわたって縦方向の監視に一貫して使用できるようになりました。ここで説明するプロトコルには、一貫したウェル乾燥を維持し、乾燥を防ぐように設計された長期アプリケーション用の元のプロトコルに対する2つの変更が含まれています。まず、デバイスの全体的な深さを2 mm増やして、水晶の容量を増やしました。特に低湿度環境での長時間の実験では、トレイ内の水の結晶が少なすぎると、lmNGMが乾燥しました。より多くの水結晶と共に、装置の端に沿ってウェルに添加されたアガロースの量を増やすことが必要であった。これらの井戸は、坑井の積み込み(セクション6)に続いて最初に乾燥し、収縮する傾向がありました。内側のウェルに14 μLのアガロースを使用すると、ウェルを過剰に充填することによって生じるドーム型の上部を作成することなく、ウェルを完全に充填するのに十分な量が得られました。外側のウェルに15 μLのアガロースを加えると、十分な容量が得られ、ウェルが乾燥し始めると、内側のウェルに添加された14 μLに匹敵するレベルまで縮小しました。
元のプロトコルからの最大の逸脱の1つは、ユーザーがlmNGM(セクション6)と硫酸銅(セクション7)をロードする順序を逆にすることでした。もともと、硫酸銅を最初に堀に添加し、次にウェルにlmNGM13を充填しました。プラズマ洗浄後できるだけ早くウェルにlmNGMを充填すると、lmNGMのウェル壁への付着が改善されることが観察されました。プラズマ洗浄後、長時間待つと、気泡とドーム型の上部を備えた井戸が発生し、ワームの視覚化を妨げる可能性があります。硫酸銅の添加よりもウェルへの充填を優先することは、一貫性のある高品質のlmNGM表面を確保するために、複数のデバイスを同時に準備する場合に特に重要です。最初にウェルを充填することの欠点は、プラズマクリーナーによって生成される親水性の表面改質が、ユーザーが硫酸銅の追加に移るまでに著しく摩耗してしまうことです。硫酸銅は、表面が親水性が低くなると堀を容易に流れないため、完全な被覆を達成することは困難です。界面活性剤として作用するように硫酸銅溶液に洗剤を添加すると、堀を通る溶液の流れが改善される。プラチナワイヤーピックを使用して、硫酸銅が流れにくい場所で張力を破ることにより、硫酸銅を堀にそっと導くこともできます。さらに、硫酸銅溶液を堀に残しておくと、トレイを傾けるとウェルにこぼれやすくなり、lmNGM表面を汚染します。ローディングプロセスの性質上、銅が井戸のサブセットを汚染するのを防ぐために、デバイス全体を十分に水平に保つことはほぼ不可能です。これを説明するために、硫酸銅溶液が堀から除去され(ステップ7.3)、残された残留硫酸銅は、ほとんどのワームが逃げるのを防ぐのに十分です。嫌悪バリアとしての硫酸銅の使用に関する最後の注意として、いくつかの忌避剤は、寿命を含む加齢に伴う表現型に影響を与える可能性があります。これらのマルチウェル装置における硫酸銅の使用は、Churginら13 によって検討され、寿命または発達のいずれにも検出可能な影響がないことが判明した。
プロトコルのその他のマイナーアップデートは、PDMSを準備するために取られた手順の改善に焦点を当てています。PDMSベースと硬化剤を混合した後の余分な脱気工程は、多くの気泡を発生させるプロセスであるため、追加されました。混合物を装置金型に添加する前に気泡の大部分を除去すると、第2の脱気工程後に残る気泡が最小限に抑えられる。デバイスの底部が完全に平らで均一であることを保証するために、プレート全体のイメージングに重要な機能であるガラスまたはアクリル片を充填された金型の上部に置きました。このステップは、ユーザーが各ウェルのフォーカスを手動で調整できるため、一度に1つのウェルしか検査しないアプリケーションには必須ではありませんが、それでも役立ちます。最後に、元のプロトコル(米国ペンシルベニア州フィラデルフィアで最適化)で示された40°Cとは対照的に、このバージョンのプロトコルが最適化された場所(米国アリゾナ州ツーソン)では、より高い温度(55°C)でPDMSを硬化させる必要がありました。これは、場所間の違い(気候や使用する正確な試薬や機器など)が、硬化温度や乾燥技術などのプロトコルの特定のステップに影響を与える可能性があり、これらを各サイトで最適化する必要がある可能性があることを示唆しています。たとえば、環境湿度は、スポッティング後のプレートの乾燥時間を決定する上で大きな役割を果たし、これは場所や季節によって大きく異なる可能性があります。
原則として、このマルチウェルデバイスシステムは、ペトリプレート上の標準的な明視野顕微鏡下で測定できる任意の表現型(寿命、健康寿命、非刺激/刺激運動、体のサイズと形状、運動形状)に関するデータを収集するために使用でき、個々のワームのメトリックを経時的に追跡する機能が追加されています。冒頭で述べたように、個々の全寿命データを取得する方法は他にもあります。マイクロ流体デバイス28またはマルチウェルプレート29は、個々の動物の生活史を追跡する能力を提供するが、それは液体培地中でワームを培養することによってのみである。液体環境は、固体媒体と比較してワームのトランスクリプトーム10,11,30を変化させ、一時的な水泳31、エネルギー消費の増加10,32、酸化ストレスの上昇10など、明確な生理学的および行動的変化を引き起こす可能性があります。健康老化に関連する寿命やその他の指標を液体培地と固体培地の間で直接比較できる程度は不明である。固体培養マルチウェルデバイスは、ペトリプレート上の標準的なグループ培養に匹敵する環境でのシングルワーム追跡を可能にします。デバイス壁の湾曲した構造により、ウェル内のどこにでもワームをイメージングできるため、これらのデバイスは、原則として、Worm Tracker33などのシングルワーム分析用のより高度なツールと互換性があります。
マルチウェル装置での実験の過程を通して個々の動物を監視する能力には、いくつかの制限が伴います。第一に、最適化されたプロトコルを使用しても、これらのデバイスは、ペトリプレート上の標準的な培養よりも動物ごとにセットアップするのに多くの時間を必要とするため、全体的なサンプルサイズを犠牲にして単一の動物データを提供します。ただし、ワームは個別のウェルに分離され、互いに触れ合っている間に動きを止める個々の動物を自動的に検出するなど、自動寿命測定に関連するいくつかの複雑さを取り除きます。自動化は、より複雑なセットアップで失われた時間を再キャプチャするだけでなく、よりハイスループットなスクリーニングの機会を提供します13,18。第二に、強力なストレス誘発剤(パラコートなど)や食事制限など、ワームが硫酸銅の堀よりも嫌う実験条件は、ワームが井戸から堀に逃げることにつながります。第三に、PDMSデバイスは明視野顕微鏡と暗視野顕微鏡を可能にしますが、PDMS材料は高いバックグラウンド蛍光と不均一な蛍光の両方を持つ傾向があり、後者は成形中にほこりや他の微粒子がPDMSに埋め込まれることが原因である可能性があり、蛍光顕微鏡での用途が制限されます。最後に、複数の実験で再利用されたデバイスのPDMSで観察された変色と、それに伴う寿命の短縮と逃げの増加は、メディアコンポーネントやその他の添加化学物質が時間の経過とともにPDMSに浸出することを示唆しています。これが老化表現型や薬物治療に影響を与える可能性がある程度は現在調査されています。前述のように、PDMSマルチウェル装置に類似しているが、代わりに市販のマイクロトレイを使用して単離動物を培養するシングルワーム培養の代替方法がある16。これらのマイクロトレイはポリスチレン製で、培地成分の浸出の潜在的な問題を回避し、一貫した蛍光バックグラウンドを備えているため、プレート上で直接in vivo蛍光イメージングが可能です。マイクロトレイウェルは、ここで説明するプロトコルで使用される硫酸銅の代わりにパルミチン酸で囲まれており、ストレス誘発剤や食事制限の場合でも、より嫌悪感があり、ウェルから出るワームの割合を減らします。これらの利点は、PDMSデバイスの240ワーム容量とは対照的に、マイクロトレイが1つのトレイで最大96ワームを培養できるため、ウェルの充填効率が低下するという犠牲を払って実現されます。実験の望ましい結果の詳細は、これらのシステムのどれを利用するべきかに影響します。
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Disclosures
著者らは、開示すべき利益相反はないと述べています。
Acknowledgments
この研究は、NIH R35GM133588からG.L.S.、米国医学アカデミー触媒賞、アリゾナ州理事会が管理するアリゾナ州技術研究イニシアチブ基金、およびエリソン医学財団によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
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