Langetermijnkweek en monitoring van geïsoleerde Caenorhabditis elegans op vaste media in multiwell-apparaten
Summary
Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het kweken van geïsoleerde individuele nematoden op vaste media in microgefabriceerde multi-well-apparaten. Met deze aanpak kunnen individuele dieren gedurende hun hele leven worden gevolgd op een verscheidenheid aan fenotypen die verband houden met veroudering en gezondheid, waaronder activiteit, lichaamsgrootte en -vorm, bewegingsgeometrie en overleving.
Abstract
De nematode Caenorhabditis elegans is een van de meest voorkomende modelsystemen die worden gebruikt in verouderingsonderzoek vanwege de eenvoudige en goedkope kweektechnieken, snelle reproductiecyclus (~ 3 dagen), korte levensduur (~ 3 weken) en tal van beschikbare hulpmiddelen voor genetische manipulatie en moleculaire analyse. De meest gebruikelijke benadering voor het uitvoeren van verouderingsstudies bij C. elegans, inclusief overlevingsanalyse, omvat het kweken van populaties van tientallen tot honderden dieren samen op vaste nematodengroeimedia (NGM) in petrischolen. Hoewel deze aanpak gegevens verzamelt over een populatie dieren, volgen de meeste protocollen individuele dieren niet in de loop van de tijd. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het langdurig kweken van individuele dieren op microgefabriceerde polydimethylsiloxaan (PDMS) -apparaten genaamd WorMotels. Met elk apparaat kunnen tot 240 dieren worden gekweekt in kleine putten die NGM bevatten, waarbij elke put wordt geïsoleerd door een kopersulfaathoudende gracht die voorkomt dat de dieren vluchten. Voortbouwend op de oorspronkelijke WorMotel-beschrijving, biedt dit artikel een gedetailleerd protocol voor het vormen, voorbereiden en vullen van elk apparaat, met beschrijvingen van veelvoorkomende technische complicaties en advies voor het oplossen van problemen. Binnen dit protocol zijn technieken voor het consistent laden van kleine hoeveelheden NGM, het consistent drogen van zowel de NGM als bacterieel voedsel, opties voor het leveren van farmacologische interventies, instructies voor en praktische beperkingen voor het hergebruik van PDMS-apparaten en tips voor het minimaliseren van uitdroging, zelfs in omgevingen met een lage luchtvochtigheid. Deze techniek maakt de longitudinale monitoring van verschillende fysiologische parameters mogelijk, waaronder gestimuleerde activiteit, niet-gestimuleerde activiteit, lichaamsgrootte, bewegingsgeometrie, gezondheid en overleving, in een omgeving die vergelijkbaar is met de standaardtechniek voor groepscultuur op vaste media in petrischplaten. Deze methode is compatibel met gegevensverzameling met hoge doorvoer wanneer deze wordt gebruikt in combinatie met geautomatiseerde microscopie- en analysesoftware. Ten slotte worden de beperkingen van deze techniek besproken, evenals een vergelijking van deze aanpak met een recent ontwikkelde methode die microtrays gebruikt om geïsoleerde nematoden op vaste media te kweken.
Introduction
Caenorhabditis elegans worden vaak gebruikt in verouderingsstudies vanwege hun korte generatietijd (ongeveer 3 dagen), korte levensduur (ongeveer 3 weken), gemak van kweken in het laboratorium, hoge mate van evolutionair behoud van moleculaire processen en routes met zoogdieren, en brede beschikbaarheid van genetische manipulatietechnieken. In de context van verouderingsstudies maken C. elegans het mogelijk om snel gegevens over de levensduur en verouderde populaties te genereren voor de analyse van fenotypen op latere leeftijd bij levende dieren. De typische aanpak voor het uitvoeren van wormverouderingsstudies omvat het handmatig meten van de levensduur van een populatie wormen die in groepen van 20 tot 70 dieren wordt gehouden op vaste agarnematodengroeimedia (NGM) in 6 cm petriplaten1. Het gebruik van leeftijdsgesynchroniseerde populaties maakt het mogelijk om de levensduur of cross-sectionele fenotypes in individuele dieren in de hele populatie te meten, maar deze methode sluit het monitoren van de kenmerken van individuele dieren in de loop van de tijd uit. Deze aanpak is ook arbeidsintensief, waardoor de omvang van de populatie die kan worden getest, wordt beperkt.
Er is een beperkt aantal kweekmethoden die de longitudinale monitoring van individuele C. elegans gedurende hun hele levensduur mogelijk maken, en elk heeft een verschillende reeks voor- en nadelen. Microfluïdica-apparaten, waaronder WormFarm2, NemaLife3 en de “gedrags”-chip4, onder andere 5,6,7, maken het mogelijk om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen. Het kweken van wormen in vloeibare cultuur met behulp van multi-well platen maakt het op dezelfde manier mogelijk om individuele dieren of kleine populaties van C. elegans in de loop van de tijd te volgen 8,9. De vloeibare omgeving vertegenwoordigt een andere omgevingscontext dan de gemeenschappelijke kweekomgeving op vaste media in petrischlaten, die aspecten van de dierfysiologie kunnen veranderen die relevant zijn voor veroudering, waaronder het vetgehalte en de expressie van stressresponsgenen10,11. Het vermogen om deze studies direct te vergelijken met de meerderheid van de verzamelde gegevens over ouder wordende C. elegans wordt beperkt door verschillen in potentieel belangrijke omgevingsvariabelen. De Worm Corral12 is een benadering die is ontwikkeld om individuele dieren te huisvesten in een omgeving die de typische vaste mediacultuur beter nabootst. De Worm Corral bevat een afgesloten kamer voor elk dier op een microscoopglaasje met behulp van hydrogel, waardoor geïsoleerde dieren longitudinaal kunnen worden gevolgd. Deze methode maakt gebruik van standaard brightfield-beeldvorming om morfologische gegevens vast te leggen, zoals lichaamsgrootte en activiteit. Dieren worden echter als embryo’s in de hydrogelomgeving geplaatst, waar ze hun hele leven ongestoord blijven. Dit vereist het gebruik van voorwaardelijk steriele mutante of transgene genetische achtergronden, wat zowel de capaciteit voor genetische screening beperkt, aangezien elke nieuwe mutatie of transgen moet worden gekruist naar een achtergrond met voorwaardelijke steriliteit, als de capaciteit voor geneesmiddelenscreening, aangezien behandelingen slechts eenmaal kunnen worden toegepast op de dieren als embryo’s.
Een alternatieve methode ontwikkeld door het Fang-Yen lab maakt het mogelijk om wormen te kweken op vaste media in individuele putten van een microgefabriceerd polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat genaamd een WorMotel13,14. Elk apparaat wordt in een lade met één put geplaatst (d.w.z. met dezelfde afmetingen als een plaat met 96 putten) en heeft 240 putten gescheiden door een gracht gevuld met een aversieve oplossing om te voorkomen dat de wormen tussen putten reizen. Elke put kan een enkele worm huisvesten voor de duur van zijn levensduur. Het apparaat is omgeven door waterabsorberende polyacrylamide-gelpellets (aangeduid als “waterkristallen”) en de lade is verzegeld met Parafilm-laboratoriumfilm om de luchtvochtigheid te handhaven en de uitdroging van de media te minimaliseren. Met dit systeem kunnen gegevens over gezondheid en levensduur voor individuele dieren worden verzameld, terwijl het gebruik van vaste media de omgeving die dieren ervaren in de overgrote meerderheid van de gepubliceerde C. elegans levensduurstudies beter samenvat, waardoor directere vergelijkingen mogelijk zijn. Onlangs is een vergelijkbare techniek ontwikkeld met behulp van polystyreenmicrotrays die oorspronkelijk werden gebruikt voor microcytotoxiciteitstests15 in plaats van het PDMS-apparaat16. De microtray-methode maakt het mogelijk om geïndividualiseerde gegevens te verzamelen voor wormen die op vaste media zijn gekweekt en heeft een verbeterde capaciteit voor het bevatten van wormen onder omstandigheden die normaal gesproken vluchten zouden veroorzaken (bijv. Stressoren of dieetbeperking), met als afweging dat elke microtray slechts 96 dieren kan bevatten16, terwijl het multi-well apparaat dat hier wordt gebruikt tot 240 dieren kan bevatten.
Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het voorbereiden van multi-well-apparaten dat is geoptimaliseerd voor plaat-tot-plaatconsistentie en de voorbereiding van meerdere apparaten parallel. Dit protocol is aangepast van het oorspronkelijke protocol van het Fang-Yen laboratorium13. Specifiek zijn er beschrijvingen voor technieken om besmetting te minimaliseren, de consistente droging van zowel de vaste media als de bacteriële voedselbron te optimaliseren en RNAi en medicijnen te leveren. Dit systeem kan worden gebruikt om individuele gezondheid, levensduur en andere fenotypen te volgen, zoals lichaamsgrootte en -vorm. Deze multi-well apparaten zijn compatibel met bestaande high-throughput systemen om de levensduur te meten, die veel van de handmatige arbeid die betrokken is bij traditionele levensduurexperimenten kan verwijderen en de mogelijkheid biedt voor geautomatiseerde, directe levensduurmeting en gezondheidstracking in individuele C. elegans op schaal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het WorMotel-systeem is een krachtig hulpmiddel voor het verzamelen van geïndividualiseerde gegevens voor honderden geïsoleerde C. elegans in de loop van de tijd. Na de eerdere studies met behulp van multi-well-apparaten voor toepassingen in ontwikkelingsrust, locomotorisch gedrag en veroudering, was het doel van dit werk om de voorbereiding van multi-well-apparaten te optimaliseren voor de langetermijnmonitoring van activiteit, gezondheid en levensduur op een manier met een hogere doorvoer. Dit werk biedt een…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH R35GM133588 aan G.L.S., een United States National Academy of Medicine Catalyst Award aan G.L.S., het State of Arizona Technology and Research Initiative Fund beheerd door de Arizona Board of Regents en de Ellison Medical Foundation.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
References
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Freitas, S. Worm Paparazzi – A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , (2021).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
- Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
- Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
- McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
- Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
- Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
- Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
