Cultivo a largo plazo y monitorización de Caenorhabditis elegans aislada en medios sólidos en dispositivos multipocillos
Summary
Aquí se presenta un protocolo optimizado para cultivar nematodos individuales aislados en medios sólidos en dispositivos microfabricados de múltiples pocillos. Este enfoque permite que los animales individuales sean monitoreados a lo largo de sus vidas para una variedad de fenotipos relacionados con el envejecimiento y la salud, incluida la actividad, el tamaño y la forma del cuerpo, la geometría del movimiento y la supervivencia.
Abstract
El nematodo Caenorhabditis elegans se encuentra entre los sistemas modelo más comunes utilizados en la investigación del envejecimiento debido a sus técnicas de cultivo simples y económicas, ciclo de reproducción rápido (~ 3 días), vida útil corta (~ 3 semanas) y numerosas herramientas disponibles para la manipulación genética y el análisis molecular. El enfoque más común para realizar estudios de envejecimiento en C. elegans, incluido el análisis de supervivencia, implica cultivar poblaciones de decenas a cientos de animales juntos en medios sólidos de crecimiento de nematodos (NGM) en placas de Petri. Si bien este enfoque recopila datos sobre una población de animales, la mayoría de los protocolos no rastrean animales individuales a lo largo del tiempo. Aquí se presenta un protocolo optimizado para el cultivo a largo plazo de animales individuales en dispositivos microfabricados de polidimetilsiloxano (PDMS) llamados WorMotels. Cada dispositivo permite cultivar hasta 240 animales en pequeños pozos que contienen NGM, con cada pozo aislado por un foso que contiene sulfato de cobre que evita que los animales huyan. Sobre la base de la descripción original de WorMotel, este documento proporciona un protocolo detallado para moldear, preparar y rellenar cada dispositivo, con descripciones de complicaciones técnicas comunes y consejos para la resolución de problemas. Dentro de este protocolo se encuentran técnicas para la carga consistente de NGM de pequeño volumen, el secado consistente tanto del NGM como de los alimentos bacterianos, opciones para administrar intervenciones farmacológicas, instrucciones y limitaciones prácticas para reutilizar dispositivos PDMS y consejos para minimizar la desecación, incluso en ambientes de baja humedad. Esta técnica permite el monitoreo longitudinal de varios parámetros fisiológicos, incluida la actividad estimulada, la actividad no estimulada, el tamaño corporal, la geometría del movimiento, la duración de la salud y la supervivencia, en un entorno similar a la técnica estándar para el cultivo grupal en medios sólidos en placas de Petri. Este método es compatible con la recopilación de datos de alto rendimiento cuando se utiliza junto con software automatizado de microscopía y análisis. Finalmente, se discuten las limitaciones de esta técnica, así como una comparación de este enfoque con un método recientemente desarrollado que utiliza microbandejas para cultivar nematodos aislados en medios sólidos.
Introduction
Caenorhabditis elegans se usa comúnmente en estudios de envejecimiento debido a su corto tiempo de generación (aproximadamente 3 días), corta vida útil (aproximadamente 3 semanas), facilidad de cultivo en el laboratorio, alto grado de conservación evolutiva de procesos moleculares y vías con mamíferos y amplia disponibilidad de técnicas de manipulación genética. En el contexto de los estudios de envejecimiento, C. elegans permite la rápida generación de datos de longevidad y poblaciones envejecidas para el análisis de fenotipos tardíos en animales vivos. El enfoque típico para realizar estudios de envejecimiento de gusanos consiste en medir manualmente la vida útil de una población de gusanos mantenidos en grupos de 20 a 70 animales en medios de crecimiento de nematodos de agar sólido (NGM) en placas de Petri de 6 cm1. El uso de poblaciones sincronizadas por edad permite la medición de la esperanza de vida o fenotipos transversales en animales individuales en toda la población, pero este método impide monitorear las características de animales individuales a lo largo del tiempo. Este enfoque también requiere mucha mano de obra, lo que restringe el tamaño de la población que se puede probar.
Hay un número limitado de métodos de cultivo que permiten el monitoreo longitudinal de C. elegans individuales a lo largo de su vida útil, y cada uno tiene un conjunto distinto de ventajas y desventajas. Los dispositivos de microfluídica, incluidos WormFarm2, NemaLife3 y el chipde “comportamiento” 4, entre otros 5,6,7, permiten el monitoreo de animales individuales a lo largo del tiempo. El cultivo de gusanos en cultivo líquido utilizando placas de pocillos múltiples permite de manera similar el monitoreo de animales individuales o pequeñas poblaciones de C. elegans a lo largo del tiempo 8,9. El ambiente líquido representa un contexto ambiental distinto del ambiente de cultivo común en medios sólidos en placas de Petri, que puede alterar aspectos de la fisiología animal que son relevantes para el envejecimiento, incluido el contenido de grasa y la expresión de genes de respuesta al estrés10,11. La capacidad de comparar directamente estos estudios con la mayoría de los datos recopilados sobre el envejecimiento de C. elegans está limitada por las diferencias en variables ambientales potencialmente importantes. El Worm Corral12 es un enfoque desarrollado para albergar animales individuales en un entorno que replica más de cerca la cultura típica de medios sólidos. El Corral de Gusanos contiene una cámara sellada para cada animal en un portaobjetos de microscopio utilizando hidrogel, lo que permite el monitoreo longitudinal de animales aislados. Este método utiliza imágenes estándar de campo claro para registrar datos morfológicos, como el tamaño corporal y la actividad. Sin embargo, los animales se colocan en el ambiente de hidrogel como embriones, donde permanecen inalterados durante toda su vida. Esto requiere el uso de antecedentes genéticos mutantes o transgénicos condicionalmente estériles, lo que limita tanto la capacidad de cribado genético, ya que cada nueva mutación o transgén necesita ser cruzado a un fondo con esterilidad condicional, como la capacidad de cribado de fármacos, ya que los tratamientos solo se pueden aplicar una vez a los animales como embriones.
Un método alternativo desarrollado por el laboratorio Fang-Yen permite el cultivo de gusanos en medios sólidos en pozos individuales de un dispositivo microfabricado de polidimetilsiloxano (PDMS) llamado WorMotel13,14. Cada dispositivo se coloca en una bandeja de un solo pozo (es decir, con las mismas dimensiones que una placa de 96 pocillos) y tiene 240 pozos separados por un foso lleno de una solución aversiva para evitar que los gusanos viajen entre pozos. Cada pozo puede albergar un solo gusano durante toda su vida útil. El dispositivo está rodeado por gránulos de gel de poliacrilamida que absorben agua (denominados “cristales de agua”), y la bandeja está sellada con una película de laboratorio Parafilm para mantener la humedad y minimizar la desecación de los medios. Este sistema permite recopilar datos de salud y vida útil para animales individuales, mientras que el uso de medios sólidos recapitula mejor el entorno experimentado por los animales en la gran mayoría de los estudios de vida de C. elegans publicados, lo que permite comparaciones más directas. Recientemente, se ha desarrollado una técnica similar utilizando microbandejas de poliestireno que se utilizaron originalmente para ensayos de microcitotoxicidad15 en lugar del dispositivo PDMS16. El método de microbandejas permite la recopilación de datos individualizados para gusanos cultivados en medios sólidos y ha mejorado la capacidad de contener gusanos en condiciones que normalmente causarían huida (por ejemplo, factores estresantes o restricciones dietéticas), con la desventaja de que cada microbandeja solo puede contener 96 animales16, mientras que el dispositivo de múltiples pocillos utilizado aquí puede contener hasta 240 animales.
Aquí se presenta un protocolo detallado para preparar dispositivos de múltiples pocillos que está optimizado para la consistencia de placa a placa y la preparación de múltiples dispositivos en paralelo. Este protocolo fue adaptado del protocolo original del laboratorio Fang-Yen13. Específicamente, hay descripciones de técnicas para minimizar la contaminación, optimizar el secado constante tanto de los medios sólidos como de la fuente de alimento bacteriano, y administrar ARNi y medicamentos. Este sistema se puede utilizar para rastrear la duración de la salud individual, la vida útil y otros fenotipos, como el tamaño y la forma del cuerpo. Estos dispositivos de múltiples pozos son compatibles con los sistemas de alto rendimiento existentes para medir la vida útil, lo que puede eliminar gran parte del trabajo manual involucrado en los experimentos tradicionales de vida útil y brindar la oportunidad de una medición automatizada y directa de la longevidad y el seguimiento de la salud en C. elegans individuales a escala.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema WorMotel es una poderosa herramienta para recopilar datos individualizados para cientos de C. elegans aislados a lo largo del tiempo. Después de los estudios anteriores que utilizaron dispositivos de múltiples pocillos para aplicaciones en la inactividad del desarrollo, el comportamiento locomotor y el envejecimiento, el objetivo de este trabajo fue optimizar la preparación de dispositivos de pocillos múltiples para el monitoreo a largo plazo de la actividad, la salud y la vida útil de una manera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIH R35GM133588 a G.L.S., un Premio Catalizador de la Academia Nacional de Medicina de los Estados Unidos a GLS, el Fondo de Iniciativa de Tecnología e Investigación del Estado de Arizona administrado por la Junta de Regentes de Arizona y la Fundación Médica Ellison.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
References
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