Çok Kuyulu Cihazlarda Katı Ortamda İzole Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Kültürü ve İzlenmesi
Summary
Burada sunulan, mikrofabrikasyon çok kuyucuklu cihazlarda katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesi için optimize edilmiş bir protokoldür. Bu yaklaşım, bireysel hayvanların, aktivite, vücut büyüklüğü ve şekli, hareket geometrisi ve hayatta kalma dahil olmak üzere yaşlanma ve sağlıkla ilgili çeşitli fenotipler için yaşamları boyunca izlenmesini sağlar.
Abstract
Nematod Caenorhabditis elegans , basit ve ucuz kültür teknikleri, hızlı üreme döngüsü (~ 3 gün), kısa ömrü (~ 3 hafta) ve genetik manipülasyon ve moleküler analiz için çok sayıda mevcut araç nedeniyle yaşlanma araştırmalarında kullanılan en yaygın model sistemler arasındadır. Hayatta kalma analizi de dahil olmak üzere C. elegans’ta yaşlanma çalışmaları yürütmek için en yaygın yaklaşım, Petri plakalarındaki katı nematod büyüme ortamı (NGM) üzerinde onlarca ila yüzlerce hayvanın popülasyonlarının birlikte kültürlenmesini içerir. Bu yaklaşım bir hayvan popülasyonu hakkında veri toplarken, çoğu protokol zaman içinde bireysel hayvanları izlemez. Burada, bireysel hayvanların WorMotels adı verilen mikrofabrikasyon polidimetilsiloksan (PDMS) cihazlarında uzun süreli kültürlenmesi için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır. Her cihaz, NGM içeren küçük kuyucuklarda 240’a kadar hayvanın kültürlenmesine izin verir ve her bir kuyu, hayvanların kaçmasını önleyen bakır sülfat içeren bir hendek ile izole edilir. Orijinal WorMotel açıklamasına dayanan bu makale, her bir cihazın kalıplanması, hazırlanması ve doldurulması için yaygın teknik komplikasyonların açıklamaları ve sorun giderme önerileri ile ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu protokolde, küçük hacimli NGM’nin tutarlı bir şekilde yüklenmesi, hem NGM hem de bakteriyel gıdaların tutarlı bir şekilde kurutulması için teknikler, farmakolojik müdahaleler sunma seçenekleri, PDMS cihazlarının yeniden kullanımına ilişkin talimatlar ve pratik sınırlamalar ve düşük nemli ortamlarda bile kurumayı en aza indirmek için ipuçları bulunmaktadır. Bu teknik, Petri plakalarındaki katı ortamlarda grup kültürü için standart tekniğe benzer bir ortamda, uyarılmış aktivite, uyarılmamış aktivite, vücut büyüklüğü, hareket geometrisi, sağlık süresi ve sağkalım dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik parametrelerin uzunlamasına izlenmesini sağlar. Bu yöntem, otomatik mikroskopi ve analiz yazılımı ile birlikte kullanıldığında yüksek verimli veri toplama ile uyumludur. Son olarak, bu tekniğin sınırlamaları tartışılmakta ve bu yaklaşımın katı ortam üzerinde izole nematodları kültürlemek için mikro tepsiler kullanan yeni geliştirilen bir yöntemle karşılaştırılması tartışılmaktadır.
Introduction
Caenorhabditis elegans , kısa üretim süreleri (yaklaşık 3 gün), kısa ömürleri (yaklaşık 3 hafta), laboratuvarda yetiştirme kolaylığı, memelilerle moleküler süreçlerin ve yolakların yüksek derecede evrimsel olarak korunması ve genetik manipülasyon tekniklerinin geniş mevcudiyeti nedeniyle yaşlanma çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Yaşlanma çalışmaları bağlamında, C. elegans , canlı hayvanlarda geç yaşam fenotiplerinin analizi için uzun ömür verilerinin ve yaşlı popülasyonların hızlı bir şekilde üretilmesine izin verir. Solucan yaşlanma çalışmalarını yürütmek için tipik yaklaşım, 6 cm Petri plakalarında katı agar nematod büyüme ortamı (NGM) üzerinde 20 ila 70 hayvanlık gruplar halinde tutulan bir solucan popülasyonunun ömrünün manuel olarak ölçülmesini içerir1. Yaş senkronize popülasyonların kullanılması, popülasyondaki bireysel hayvanlarda yaşam süresinin veya kesitsel fenotiplerin ölçülmesine izin verir, ancak bu yöntem bireysel hayvanların zaman içindeki özelliklerinin izlenmesini engeller. Bu yaklaşım aynı zamanda emek yoğundur, bu nedenle test edilebilecek nüfusun büyüklüğünü kısıtlar.
Bireysel C. elegans’ın yaşamları boyunca uzunlamasına izlenmesine izin veren sınırlı sayıda kültür yöntemi vardır ve her birinin farklı avantajları ve dezavantajları vardır. WormFarm2, NemaLife3 ve “davranış” çipi4 de dahil olmak üzere mikroakışkan cihazlar, diğerlerinin yanı sıra 5,6,7, bireysel hayvanların zaman içinde izlenmesine izin verir. Çok kuyucuklu plakalar kullanılarak sıvı kültürde solucanların kültürlenmesi, benzer şekilde, bireysel hayvanların veya küçük C. elegans popülasyonlarının zaman içinde izlenmesini sağlar 8,9. Sıvı ortam, Petri plakalarındaki katı ortamlardaki ortak kültür ortamından farklı bir çevresel bağlamı temsil eder; bu, yağ içeriği ve stres-tepki genlerinin ekspresyonu da dahil olmak üzere hayvan fizyolojisinin yaşlanma ile ilgili yönlerini değiştirebilir10,11. Bu çalışmaları yaşlanan C. elegans hakkında toplanan verilerin çoğunluğu ile doğrudan karşılaştırma yeteneği, potansiyel olarak önemli çevresel değişkenlerdeki farklılıklarla sınırlıdır. Worm Corral12, tipik katı medya kültürünü daha yakından kopyalayan bir ortamda bireysel hayvanları barındırmak için geliştirilen bir yaklaşımdır. Worm Corral, hidrojel kullanan bir mikroskop slaytında her hayvan için kapalı bir oda içerir ve izole hayvanların uzunlamasına izlenmesini sağlar. Bu yöntem, vücut büyüklüğü ve aktivitesi gibi morfolojik verileri kaydetmek için standart parlak alan görüntülemeyi kullanır. Bununla birlikte, hayvanlar hidrojel ortamına embriyo olarak yerleştirilir ve burada ömürleri boyunca rahatsız edilmeden kalırlar. Bu, şartlı olarak steril mutant veya transgenik genetik arka planların kullanılmasını gerektirir, bu da hem genetik tarama kapasitesini sınırlar, çünkü her yeni mutasyon veya transgenin koşullu kısırlığa sahip bir arka plana geçmesi gerekir hem de ilaç tarama kapasitesi, çünkü tedaviler embriyo olarak hayvanlara yalnızca bir kez uygulanabilir.
Fang-Yen laboratuvarı tarafından geliştirilen alternatif bir yöntem, WorMotel13,14 adı verilen mikrofabrikasyon polidimetilsiloksan (PDMS) cihazının bireysel kuyularında katı ortam üzerinde solucanların yetiştirilmesine izin verir. Her cihaz tek kuyucuklu bir tepsiye yerleştirilir (yani, 96 delikli bir plaka ile aynı boyutlarda) ve solucanların kuyucuklar arasında hareket etmesini önlemek için önleyici bir çözelti ile doldurulmuş bir hendekle ayrılmış 240 kuyucuğa sahiptir. Her kuyu, ömrü boyunca tek bir solucanı barındırabilir. Cihaz su emici poliakrilamid jel peletleri (“su kristalleri” olarak adlandırılır) ile çevrilidir ve tepsi, nemi korumak ve ortamın kurumasını en aza indirmek için Parafilm laboratuvar filmi ile kapatılmıştır. Bu sistem, bireysel hayvanlar için sağlık süresi ve yaşam süresi verilerinin toplanmasına izin verirken, katı ortam kullanımı, yayınlanmış C. elegans yaşam süresi çalışmalarının büyük çoğunluğunda hayvanların yaşadığı çevreyi daha iyi özetler ve böylece daha doğrudan karşılaştırmalara izin verir. Son zamanlarda, PDMS cihazı16 yerine mikrositotoksisite testleri15 için orijinal olarak kullanılan polistiren mikrotepsiler kullanılarak benzer bir teknik geliştirilmiştir. Mikrotepsi yöntemi, katı ortamda kültürlenen solucanlar için kişiselleştirilmiş verilerin toplanmasına izin verir ve tipik olarak kaçmaya neden olacak koşullar altında (örneğin, stresörler veya diyet kısıtlaması) solucanları içerme kapasitesini artırır; bunun karşılığı, her mikro tepsinin yalnızca 96 hayvan içerebileceğidir16, oysa burada kullanılan çok kuyucuklu cihaz 240’a kadar hayvan içerebilir.
Burada, plakadan plakaya tutarlılık ve paralel olarak birden fazla cihazın hazırlanması için optimize edilmiş çok kuyulu cihazların hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, Fang-Yen laboratuvarı13’teki orijinal protokolden uyarlanmıştır. Özellikle, kontaminasyonu en aza indirmek, hem katı ortamın hem de bakteriyel gıda kaynağının tutarlı kurumasını optimize etmek ve RNAi ve ilaçlar vermek için teknikler için açıklamalar vardır. Bu sistem, bireysel sağlık süresini, ömrünü ve vücut büyüklüğü ve şekli gibi diğer fenotipleri izlemek için kullanılabilir. Bu çok kuyucuklu cihazlar, kullanım ömrünü ölçmek için mevcut yüksek verimli sistemlerle uyumludur, bu da geleneksel yaşam süresi deneylerinde yer alan el emeğinin çoğunu ortadan kaldırabilir ve bireysel C. elegans’ta otomatik, doğrudan uzun ömür ölçümü ve sağlık takibi için fırsat sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
WorMotel sistemi, zaman içinde yüzlerce izole C. elegans için kişiselleştirilmiş veriler toplamak için güçlü bir araçtır. Gelişimsel sessizlik, lokomotor davranış ve yaşlanma uygulamaları için çok kuyulu cihazların kullanıldığı daha önceki çalışmaları takiben, bu çalışmanın amacı, aktivitenin, sağlığın ve ömrün uzun vadeli izlenmesi için çok kuyulu cihazların hazırlanmasını optimize etmekti. Bu çalışma, orijinal protokol13’teki adımların …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NIH R35GM133588 to G.L.S., G.L.S.’ye Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Tıp Akademisi Katalizör Ödülü, Arizona Regents Kurulu tarafından yönetilen Arizona Eyaleti Teknoloji ve Araştırma Girişimi Fonu ve Ellison Tıp Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
References
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Freitas, S. Worm Paparazzi – A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , (2021).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
- Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
- Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
- McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
- Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
- Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
- Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
