Multi-well 장치의 고체 배지에서 분리된 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 모니터링Long-term culture and monitoring of isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-well devices
Summary
여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.
Abstract
선충류 Caenorhabditis elegans 는 간단하고 저렴한 배양 기술, 빠른 번식 주기(~3일), 짧은 수명(~3주), 유전자 조작 및 분자 분석을 위한 수많은 도구로 인해 노화 연구에 사용되는 가장 일반적인 모델 시스템 중 하나입니다. 생존 분석을 포함하여 예쁜꼬마선충에서 노화 연구를 수행하는 가장 일반적인 접근 방식은 페트리 플레이트의 고체 선충 성장 배지(NGM)에서 수십에서 수백 마리의 동물 개체군을 함께 배양하는 것입니다. 이 접근 방식은 동물 개체군에 대한 데이터를 수집하지만 대부분의 프로토콜은 시간이 지남에 따라 개별 동물을 추적하지 않습니다. 여기에 제시된 것은 WorMotels라고 하는 미세 가공 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치에서 개별 동물을 장기간 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 각 장치는 NGM이 포함된 작은 우물에서 최대 240마리의 동물을 배양할 수 있으며, 각 우물은 동물이 도망치는 것을 방지하는 황산구리 함유 해자로 격리됩니다. 원래 WorMotel 설명을 기반으로 하는 이 백서는 일반적인 기술적 복잡성에 대한 설명과 문제 해결을 위한 조언과 함께 각 장치의 성형, 준비 및 채우기에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 소량 NGM의 일관된 로딩을 위한 기술, NGM과 박테리아 식품의 일관된 건조, 약리학적 개입을 제공하기 위한 옵션, PDMS 장치 재사용에 대한 지침 및 실질적인 제한, 습도가 낮은 환경에서도 건조를 최소화하기 위한 팁이 있습니다. 이 기술을 사용하면 페트리 플레이트의 고체 배지에서 그룹 배양을 위한 표준 기술과 유사한 환경에서 자극된 활동, 자극되지 않은 활동, 신체 크기, 움직임 기하학, 건강 범위 및 생존을 포함한 다양한 생리학적 매개변수의 종단 모니터링이 가능합니다. 이 방법은 자동화된 현미경 및 분석 소프트웨어와 함께 사용할 때 고처리량 데이터 수집과 호환됩니다. 마지막으로, 이 기술의 한계에 대해 논의하고 이 접근 방식을 마이크로트레이를 사용하여 고체 배지에서 분리된 선충을 배양하는 최근에 개발된 방법과 비교합니다.
Introduction
예쁜꼬마선충은 짧은 생성 시간(약 3일), 짧은 수명(약 3주), 실험실에서의 재배 용이성, 포유류와의 분자 과정 및 경로의 높은 수준의 진화적 보존, 유전자 조작 기술의 광범위한 가용성으로 인해 노화 연구에 일반적으로 사용됩니다. 노화 연구의 맥락에서 C. elegans 는 살아있는 동물의 노년기 표현형 분석을 위해 수명 데이터와 노인 인구의 빠른 생성을 허용합니다. 웜 노화 연구를 수행하기 위한 일반적인 접근 방식은 6cm 페트리 플레이트의 고체 한천 선충 성장 배지(NGM)에서 20-70마리의 동물 그룹으로 유지되는 웜 개체군의 수명을 수동으로 측정하는 것입니다1. 연령 동기화 개체군을 사용하면 개체군 전체에 걸쳐 개별 동물의 수명 또는 단면 표현형을 측정할 수 있지만 이 방법은 시간 경과에 따른 개별 동물의 특성을 모니터링하는 것을 배제합니다. 이 접근 방식은 또한 노동 집약적이므로 테스트할 수 있는 모집단의 크기를 제한합니다.
일생 동안 개별 예쁜꼬마선충의 종단적 모니터링을 허용하는 배양 방법은 제한되어 있으며 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다. WormFarm2, NemaLife3 및 “행동” 칩4(5,6,7)을 포함한 미세 유체 장치를 사용하면 시간 경과에 따른 개별 동물을 모니터링할 수 있습니다. 다중 웰 플레이트를 사용하여 액체 배양에서 벌레를 배양하는 것은 시간이 지남에 따라 개별 동물 또는 작은 개체군의 모니터링을 가능하게 합니다 8,9. 액체 환경은 지방 함량 및 스트레스 반응 유전자10,11의 발현을 포함하여 노화와 관련된 동물 생리학의 측면을 변경할 수 있는 페트리 플레이트의 고체 배지에 대한 일반적인 배양 환경과 구별되는 환경적 맥락을 나타냅니다. 이러한 연구를 노화 예쁜꼬마선충에 대해 수집된 대부분의 데이터와 직접 비교할 수 있는 능력은 잠재적으로 중요한 환경 변수의 차이로 인해 제한됩니다. Worm Corral12는 전형적인 고체 미디어 문화를보다 밀접하게 복제하는 환경에 개별 동물을 수용하기 위해 개발 된 한 가지 접근 방식입니다. Worm Corral에는 하이드로겔을 사용하는 현미경 슬라이드에 각 동물을 위한 밀폐된 챔버가 포함되어 있어 분리된 동물의 종단 모니터링이 가능합니다. 이 방법은 표준 명시야 이미징을 사용하여 신체 크기 및 활동과 같은 형태학적 데이터를 기록합니다. 그러나 동물은 배아로 하이드로겔 환경에 배치되어 평생 동안 방해받지 않습니다. 이를 위해서는 조건부 무균 돌연변이 또는 형질전환 유전자 배경의 사용이 필요하며, 이는 각각의 새로운 돌연변이 또는 이식 유전자가 조건부 불임의 배경으로 교차되어야 하기 때문에 유전자 스크리닝 능력과 치료가 배아로서 동물에게 한 번만 적용될 수 있기 때문에 약물 스크리닝 능력을 모두 제한합니다.
Fang-Yen 연구실에서 개발한 대체 방법은 WorMotel13,14라고 하는 미세 가공된 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치의 개별 웰에 있는 고체 배지에서 벌레를 배양할 수 있습니다. 각 장치는 단일 웰 트레이(즉, 96웰 플레이트와 동일한 치수)에 배치되고 웜이 웰 사이를 이동하는 것을 방지하기 위해 혐오 용액으로 채워진 해자로 분리된 240개의 웰이 있습니다. 각 우물은 수명 동안 단일 웜을 수용 할 수 있습니다. 이 장치는 수분 흡수 폴리아크릴아미드 겔 펠릿(“물 결정”이라고 함)으로 둘러싸여 있으며 트레이는 습도를 유지하고 매체의 건조를 최소화하기 위해 Parafilm 실험실 필름으로 밀봉되어 있습니다. 이 시스템을 사용하면 개별 동물에 대한 건강 수명 및 수명 데이터를 수집할 수 있으며, 고체 매체를 사용하면 출판된 대부분의 예쁜꼬마선충 수명 연구에서 동물이 경험한 환경을 더 잘 요약하여 보다 직접적인 비교가 가능합니다. 최근에, PDMS 장치(16) 대신에 원래 미세세포독성 분석(15)에 사용되었던 폴리스티렌 마이크로트레이를 사용하여 유사한 기술이 개발되었다. 마이크로트레이 방법은 고체 배지 상에서 배양된 웜에 대한 개별화된 데이터의 수집을 허용하고, 전형적으로 도피를 유발하는 조건(예를 들어, 스트레스 요인 또는 식이 제한) 하에서 웜을 함유하는 능력을 향상시켰으며, 각 마이크로트레이는 96마리의 동물만 포함할 수 있는 반면(16), 여기서 활용되는 멀티웰 장치는 최대 240마리의 동물을 포함할 수 있다.
여기에 제시된 것은 플레이트 간 일관성 및 여러 장치의 병렬적 준비에 최적화된 멀티웰 장치를 준비하기 위한 자세한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 Fang-Yen 실험실13의 원래 프로토콜에서 채택되었습니다. 특히, 오염을 최소화하고, 고체 배지와 박테리아 식품 공급원 모두의 일관된 건조를 최적화하고, RNAi 및 약물을 전달하는 기술에 대한 설명이 있습니다. 이 시스템은 개인의 건강 수명, 수명 및 신체 크기 및 모양과 같은 기타 표현형을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 멀티웰 장치는 기존의 고처리량 시스템과 호환되어 수명을 측정할 수 있으며, 이를 통해 기존 수명 실험과 관련된 많은 수작업을 제거하고 대규모로 개별 예쁜꼬마선충의 자동화된 직접 수명 측정 및 건강 추적 기회를 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
WorMotel 시스템은 시간이 지남에 따라 수백 개의 고립된 예쁜꼬마선충 에 대한 개별화된 데이터를 수집하기 위한 강력한 도구입니다. 발달 정지, 운동 행동 및 노화 응용 분야에 다중 웰 장치를 사용한 초기 연구에 이어 이 작업의 목표는 더 높은 처리량 방식으로 활동, 건강 및 수명을 장기간 모니터링하기 위한 다중 웰 장치의 준비를 최적화하는 것이었습니다. 이 작업은 원래의 프로토콜(<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH R35GM133588에서 GLS로, GLS에 대한 미국 국립 의학 아카데미 촉매 상, 애리조나 이사회에서 관리하는 애리조나 주 기술 및 연구 이니셔티브 기금 및 Ellison Medical Foundation의 지원을 받았습니다.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
References
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