Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Mus In vivo placenta målrettet CRISPR-manipulation

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/64760
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 1,2,3,4
1Interdisciplinary Graduate Program in Genetics, University of Iowa, 2Department of Psychiatry, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Iowa Neuroscience Institute, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Hawk-IDDRC, University of Iowa

Summary

Her beskriver vi en tidsspecifik metode til effektivt at manipulere kritiske udviklingsveje i musemoderkagen in vivo. Dette udføres ved injektion og elektroporation af CRISPR-plasmider i moderkagen hos gravide mødre på embryonal dag 12.5.

Abstract

Placenta er et vigtigt organ, der regulerer og opretholder pattedyrs udvikling i livmoderen. Placenta er ansvarlig for overførsel af næringsstoffer og affald mellem moderen og fosteret og produktion og levering af vækstfaktorer og hormoner. Placentagenetiske manipulationer hos mus er afgørende for at forstå moderkagens specifikke rolle i prænatal udvikling. Placenta-specifikke Cre-ekspressive transgene mus har varierende effektivitet, og andre metoder til placenta genmanipulation kan være nyttige alternativer. Dette papir beskriver en teknik til direkte at ændre placenta genekspression ved hjælp af CRISPR-genmanipulation, som kan bruges til at ændre ekspressionen af målrettede gener. Ved hjælp af en relativt avanceret kirurgisk tilgang gennemgår gravide mødre en laparotomi på embryonal dag 12.5 (E12.5), og et CRISPR-plasmid leveres af en glasmikropipette ind i de enkelte moderkager. Plasmidet elektroporeres straks efter hver injektion. Efter dæmningsgenopretning kan moderkagerne og embryonerne fortsætte udviklingen indtil vurdering på et senere tidspunkt. Evalueringen af moderkagen og afkom efter brug af denne teknik kan bestemme rollen som tidsspecifik placenta funktion i udvikling. Denne type manipulation vil give mulighed for en bedre forståelse af, hvordan placenta genetik og funktion påvirker fostrets vækst og udvikling i flere sygdomssammenhænge.

Introduction

Placenta er et vigtigt organ involveret i fostrets udvikling. Placentas hovedrolle er at tilvejebringe væsentlige faktorer og regulere overførslen af næringsstoffer og affald til og fra fosteret. Pattedyrs placentas består af både føtal og modervæv, som udgør foster-moderens grænseflade, og dermed genetikken hos både moderen og fosteret påvirker funktion1. Genetiske anomalier eller nedsat funktion af moderkagen kan drastisk ændre fostrets udvikling. Tidligere arbejde har vist, at placenta genetik og udvikling er forbundet med den ændrede udvikling af specifikke organsystemer hos fosteret. Især er abnormiteter i moderkagen forbundet med ændringer i fostrets hjerne, hjerte og vaskulære system 2,3,4,5.

Transporten af hormoner, vækstfaktorer og andre molekyler fra moderkagen til fosteret spiller en stor rolle i fostrets udvikling6. Det har vist sig, at ændring af placentaproduktionen af specifikke molekyler kan ændre neuroudvikling. Moderens inflammation kan øge produktionen af serotonin ved at ændre tryptophan (TRP) metabolisk genekspression i moderkagen, hvilket efterfølgende skaber en ophobning af serotonin i fostrets hjerne7. Andre undersøgelser har fundet placentaabnormiteter sammen med hjertefejl. Abnormiteter i moderkagen menes at bidrage til medfødte hjertefejl, den mest almindelige fødselsdefekt hos mennesker8. En nylig undersøgelse har identificeret flere gener, der har lignende cellulære veje i både moderkagen og hjertet. Hvis de forstyrres, kan disse veje forårsage defekter i begge organer9. Defekterne i moderkagen kan forværre medfødte hjertefejl. Placentagenetikkens og funktionens rolle på udviklingen af det specifikke føtale organsystem er et voksende fagområde.

Mus har hæmokorial placentas og andre træk ved menneskelige placentas, hvilket gør dem meget nyttige modeller til undersøgelse af menneskelig sygdom1. På trods af moderkagens betydning mangler der i øjeblikket målrettede in vivo-genetiske manipulationer. Desuden er der i øjeblikket flere muligheder for knockouts eller knockdowns end overekspression eller gain-of-function manipulationer i moderkagen10. Der er flere transgene Cre-ekspressive linjer til placenta-specifik manipulation, hver i forskellige trofoblastlinjer på forskellige tidspunkter. Disse omfatter Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER og Gcm1-Cre 11,12,13,14. Mens disse Cre-transgener er effektive, er de muligvis ikke i stand til at manipulere nogle gener på bestemte tidspunkter. En anden almindeligt anvendt metode til enten knockout eller overexpress placenta-genekspression er indsættelse af lentivirale vektorer i blastocystkultur, hvilket forårsager en trofoblastspecifik genetisk manipulation15,16. Denne teknik giver mulighed for en robust ændring i placentagenekspressionen tidligt i udviklingen. Anvendelsen af RNA-interferens in vivo er blevet sparsomt udnyttet i moderkagen. Indsættelsen af shRNA-plasmider kan udføres på samme måde som CRIPSR-teknikken beskrevet i dette papir. Dette er blevet gjort ved E13.5 for med succes at reducere PlGF-ekspression i moderkagen, med indvirkning på afkom hjernevaskulatur17.

Ud over teknikker, der primært anvendes til knockout eller knockdown, udføres inducerende overekspression almindeligvis med adenovirus eller indsættelse af et eksogent protein. De teknikker, der anvendes til overekspression, har varierende succesrater og er for det meste blevet udført senere i drægtigheden. For at undersøge rollen som insulinlignende vækstfaktor 1 (IGF-1) i placentafunktionen blev der udført en adenoviralmedieret placentagenoverførsel for at inducere overekspression af IGF-1-genet 18,19. Dette blev udført sent i musedrægtigheden på E18.5 via direkte placentainjektion. For at give yderligere muligheder og omgå mulige fejl i etablerede placentagenetiske manipulationer, såsom Cre-Lox-kombinationsfejl, adenovirusets mulige toksicitet og shRNA's off-target-virkninger, kan in vivo direkte CRISPR-manipulation af moderkagen anvendes20,21,22. Denne model blev udviklet for at afhjælpe manglen på overekspressionsmodeller og for at skabe en model med fleksibilitet.

Denne teknik er baseret på Lecuyer et al.'s arbejde, hvor shRNA- og CRISPR-plasmider blev målrettet direkte in vivo til museplacentas for at ændre PlGF-ekspression 17. Denne teknik kan bruges til direkte at ændre placentagenekspression ved hjælp af CRISPR-manipulation på flere tidspunkter; til dette arbejde blev E12.5 valgt. Placenta er modnet på dette tidspunkt og er stor nok til at manipulere, hvilket muliggør indsættelse af et specifikt CRISPR-plasmid på E12.5, hvilket kan have en betydelig indvirkning på fostrets udvikling fra midten til sen graviditet23,24. I modsætning til transgene tilgange, men ligner virale induktioner eller RNA-interferens, tillader denne teknik overekspression eller knockout på bestemte tidspunkter ved hjælp af en relativt avanceret kirurgisk tilgang, hvorved mulig nedsat placentation eller embryonal dødelighed fra tidligere ændringer undgås. Da kun få placentas modtager eksperimentel eller kontrolplasmidet i et kuld, giver tilgangen mulighed for to typer interne kontroller. Disse kontroller er dem, der injiceres og elektroporeres med det passende kontrolplasmid, og dem, der ikke modtager nogen direkte manipulation. Denne teknik blev optimeret til at skabe en overekspression af IGF-1 genet i museplacenta via en synergistisk aktiveringsmediator (SAM) CRISPR plasmid. IGF-1 genet blev valgt, da IGF-1 er et essentielt væksthormon leveret til fosteret, der primært produceres i moderkagen før fødslen25,26. Denne nye placenta-målrettede CRISPR-teknik giver mulighed for direkte manipulation for at hjælpe med at definere forbindelsen mellem placenta funktion og fosterudvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med og overholdelse af føderale regler og University of Iowa politik og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Dyr og husdyrhold

  1. Hold dyrene i en 12 timers dagslyscyklus med mad og vand ad libitum.
  2. Brug CD-1 hunmus i alderen 8-15 uger. Brug tilstedeværelsen af et kopulatorisk stik til at identificere E0.5.
  3. På E0.5 skal du enkeltvis huse de gravide dæmninger.

2. Kalibrering af mikropipetten

BEMÆRK: Kalibreringen af mikropipetten skal udføres før operationen, når det er muligt.

  1. Før mikropipetten fremstilles og kalibreres, fortyndes alle plasmiderne til den anbefalede koncentration (0,1 μg/μL) i DNasefrit vand. Bland plasmidet med passende fortyndet Fast Green-farvestof (1 μg/μL i PBS) (endelig plasmidkoncentration: 0,06 μg/μL).
  2. Træk mikropipetter ved hjælp af 10 cm glaskapillærer med en ydre diameter på 1,5 mm og en indvendig diameter på 0,86 mm med en mikropipettetrækker.
  3. Afbryd forsigtigt spidsen af en mikropipette (2-3 mm) med sterile tang.
  4. Læg mikropipetten i en mikrokapillærspids, der er fastgjort til en mikroinjektor. Sørg for, at mikroinjektoren er fastgjort til mikroinjektionsmaskinen, og at der er tilstrækkelige nitrogenniveauer til at kalibrere mikropipetten.
  5. Når mikropipetten er fastgjort til mikroinjektoren, fyldes den med Fast Green-farvestofopløsningen for at udføre kalibreringen (1 μg/μL i PBS). Mikropipetten kalibreres for at injicere et volumen på ca. 3,5 μL. Mikropipetten tømmes ("ryddes") som forberedelse til ilægning af plasmidopløsningerne som nedenfor.
    BEMÆRK: Hver mikropipette vil være lidt anderledes. For at undgå at beskadige moderkagen under injektionen skal injektionstiden indstilles mellem 0,5-1,5 s. Trykket skal indstilles mellem 1-8,5 psi. Kalibrer hver mikropipette separat; Hvis mikropipetten ikke kan kalibreres inden for disse parametre, skal den ikke bruges.

3. Kirurgi (figur 1A)

BEMÆRK: For at forberede skal du rengøre overfladerne på både præparatet og kirurgiske områder med 70% ethanol. Anbring en absorberende underpude i forberedelsesområdet. I operationsområdet skal du placere en varmepude ned og derefter placere en absorberende underpude oven på denne. Steriliser alle værktøjer før operationen. Den tid, dæmningen er under anæstesi, skal være under 1 time.

  1. Bedøvelse
    1. Administrer 5 mg/kg NSAID (meloxicam) eller et andet godkendt smertestillende middel til den drægtige modermor 30 min til 1 time før operationen.
    2. Anbring den drægtige dæmning i et induktionskammer, der er fastgjort til en isofluranfordamper.
    3. Indstil vaporizeren til 4% isofluran og 3,5 l/min oxygen.
    4. Når bedøvelsen er blevet bekræftet af manglen på respons på en tåklemme og en reduceret vejrtrækningshastighed, skal du fjerne dæmningen fra induktionskammeret til forberedelsesområdet.
  2. Kirurgisk forberedelse
    1. I forberedelsesområdet skal du placere dæmningen liggende med en næsekegle.
    2. Reducer fordamperen til 2% isofluran og 3,5 l / min ilt, mens dæmningen er i næsekeglen.
    3. Barber dæmningens underliv grundigt og fjern overskydende pels. Alternativt skal du belægge den barberede mave med povidonopløsning og 70% ethanol tre gange ved hjælp af sterile applikatorer med bomuldsspids. Påfør det endelige lag povidonopløsning. For at forhindre hornhindetørring skal du placere kunstig tåregel over begge dæmningens øjne (figur 2A, B).
    4. Efter forberedelse skal du flytte dæmningen med næsekeglen til det udpegede operationsområde.
  3. Uterin laparotomi
    BEMÆRK: Brug sterile handsker under hele det kirurgiske indgreb. Skift handskerne, hvis en ikke-steril overflade kommer i berøring.
    1. I operationsområdet skal du placere dæmningen liggende og fastgøre næsekeglen på plads med tape. Sæt varmepuden under den absorberende pude til 45 °C.
    2. Brug tang og saks til at lave et ca. 2 cm midterlinjesnit gennem huden. Brug tang til at telte huden, og lav et lodret snit i huden. Efter dette skal du lave et andet snit af samme størrelse gennem bughinden for at udsætte livmoderhornene. Brug tang til at telte bughinden, mens du laver det lodrette snit (figur 2C, D).
      BEMÆRK: Manglende korrekt telt under indskæring af bughinden kan føre til et dødeligt snit i tarmene.
    3. Massér forsigtigt livmoderhornene gennem snittet ved at trykke på siderne af maven. Gør dette ved omhyggeligt at lede livmoderen uden værktøj og kun bruge fingrene for at undgå utilsigtet skade. Placer den udsatte livmoder oven på et sterilt kirurgisk gardin, der dækker moderdyrets underliv, og hold det fugtigt under hele operationen med dråber sterilt saltvand, som kan opvarmes til 30 ° C før brug efter behov (figur 2E, F).
      BEMÆRK: Livmoderhornene kan identificeres som beskrevet i Wang et al.27.
    4. Når livmoderen er udsat, skal du vælge tre par moderkager til manipulation.
      BEMÆRK: Placentas kan identificeres som beskrevet af Elmore et al.24. For at maksimere embryonernes overlevelse bør der ikke behandles mere end 6 placentas . Hvis der er færre end 12 embryoner til stede, må der ikke injiceres mere end 4 placentas. Vælg to tilstødende placentas, så den ene modtager en kontrolinjektion, og den anden modtager det eksperimentelle plasmid. Brugen af to tilstødende placentas giver mulighed for en bedre sammenligning af placentas på lignende steder i livmoderen og muliggør også en øget overlevelsesrate. De udvalgte placentapar vælges tilfældigt og fordeles i begge livmoderhorn (figur 1B).
    5. Registrer placeringen af placentamanipulationer og organisering af embryonerne i livmoderhornene, så embryonerne og moderkagen kan identificeres under indsamlingen, da en dæmning vil bære både kontrol og eksperimentelt behandlede placentas / embryoner.
  4. Placentainjektion og elektroporation af kontrolplasmidet
    BEMÆRK: For at opretholde en aseptisk teknik skal du sterilisere elektroporationspadlerne og mikroinjektoren med et koldt steriliseringsmiddel før brug. Skift handsker, hvis en ikke-steril overflade kommer i berøring.
    1. Brug den kalibrerede mikropipette til at fylde en tilstrækkelig mængde af det passende kontrolplasmid til tre injektioner. Udfør alle injektionerne i en dybde på ~0,5 mm sideværts ind i moderkagen mellem decidua (hvid) og krydsningszone (mørkerød) (figur 3A-F).
    2. Udfør injektioner i de tre kontrolplacentaer.
      BEMÆRK: Udfør alle kontrolplasmidinjektioner før de eksperimentelle injektioner for at undgå krydskontaminering af plasmiderne med mikropipetten. Dette vil gøre det muligt at bruge den samme mikropipette, da ændring af mikropipetter og kalibreringstid drastisk øger operationstiden og reducerer moderens overlevelse.
    3. Udfør elektroporation af de kontrolplasmidinjicerede placentas inden for 2 minutter efter injektionen.
    4. Til elektroporation skal du bruge et par 3 mm padler fastgjort til en elektroporationsmaskine. For at sikre CRISPR-inkorporeringseffektivitet og embryoners levedygtighed skal du bruge følgende elektroporationsindstillinger: 2 impulser, 30 V, 30 ms puls, 970 ms puls slukket, unipolær.
    5. Efter injektion, men umiddelbart før elektroporation, skal du belægge kontaktstederne med sterilt saltvand og påføre saltvand præcist på de tre steder på livmodervæggen og padlerne med en dråber eller sprøjte.
    6. Tryk forsigtigt på elektroporationspadlerne på moderkagens laterale sider. Anbring anodepadlen over injektionsstedet og katoden lige overfor (figur 4A-C).
    7. Tryk på pulsen på elektroporationsmaskinen, og vent på, at de to impulser er færdige, før du fjerner elektroporationspadlerne.
      BEMÆRK: En lille mængde hvidt skum ses ofte mellem padler og moderkage under pulser. Hvis dette ikke sker, skal du kontrollere spændingen fra padlerne med et voltmeter inden yderligere brug. Hvis aflæsningen på voltmeteret ikke svarer til elektroporationsspændingsindstillingen, er padlerne ikke-funktionelle.
  5. Placentainjektion og elektroporation af det eksperimentelle plasmid
    1. Følg de samme instruktioner fra trin 3.4.1. til trin 3.4.2. ved anvendelse af det eksperimentelle plasmid i stedet for kontrolplasmidet.
    2. Udfør elektroporation af alle tre eksperimentelle injicerede placentas inden for 2 minutter efter injektionen. Dette bør udføres på samme måde som for dem, der injiceres med kontrolplasmider. Følg trin 3.4.4. til trin 3.4.7.
  6. Afslutning af operationen
    1. Når placentamanipulationen er afsluttet, masseres forsigtigt livmoderhornene tilbage inde i bughulen ved kun at bruge fingrene (figur 5A).
    2. Udfør først dobbeltknyttede enkeltsuturer på buglaget ved hjælp af belagte og flettede opløselige suturer, der er 45 cm lange med en 13 mm 3/8c nålelegering. Placer suturerne 2-3 mm fra hinanden (figur 5B).
    3. Efter suturering af peritoneumlaget sutureres huden med opløselige suturer. Tredobbelt knude de enkelte suturer 2-3 mm fra hinanden for at sikre, at dæmningen ikke kan fortryde sutureringen (figur 5C).
    4. Når sutureringen er afsluttet, indstilles isofluran til 1% og ilt til 3,5 l / min, og vævslim påføres suturerne på huden (figur 5D).
      BEMÆRK: Vævslim er valgfrit, men anbefales for at forhindre genåbning af snittet på grund af dæmningstygning.
    5. Når vævslimet er tørret, skal du slukke for fordamperen og fjerne dæmningen fra operationsområdet. Placer dæmningen i et støttende bur på ryggen.

4. Pleje og overvågning efter operationen

  1. Lad den drægtige mor komme sig i et rent bur under opsyn i mindst 30 minutter for at sikre, at der ikke opstår umiddelbare komplikationer ved operationen. Overhold indtil det er helt ambulant og kan vende på fødderne uden hjælp. Enkeltvis hus dæmningen efter operationen.
  2. Følg den institutionelle postoperative pleje og overvågning indtil embryoindsamling. Optag dæmningens vægt, og overvåg suturerne og snitstedet dagligt.

5. E14.5 placenta opsamling

  1. På E14.5 bedøves dæmningen dybt med en ketamin / xylazincocktail (1 mg / ml ketamin og 0,1 mg / ml xylazin), og derefter cervikalt dislokeres dæmningen.
  2. Lav et V-formet snit i dæmningens underliv med en saks, og fjern livmoderen. Læg straks på et 5 cm petrifad på is. Brug tang til forsigtigt at fjerne embryoet og den tilsvarende placenta fra livmoderen.
    BEMÆRK: Opbevar en fortegnelse over embryoets placering og tilsvarende placenta i livmoderhornene for at bestemme, hvem der modtog den direkte manipulation under operationen.
  3. Optag placenta vægte. Brug RNAse-fri tang og barbermaskiner til at skære moderkagen i halve ned midterlinjen. Sæt halvdelen i 4% PFA ved 4 °C. Den resterende halvdel halveres igen, og de resterende to fjerdedele opbevares ved -80 °C i to rør, hvoraf det ene er med RNA-lagerreagens.
    BEMÆRK: Embryoner og andet modervæv kan opbevares fra samlingen ved -80 °C til fremtidig brug.

6. Analyse af placenta genekspression

  1. Brug kvart af moderkagen opbevaret ved -80 °C i RNA-lagerreagens.
  2. Behandl moderkagen for qPCR som beskrevet i Elser et al. ved hjælp af Trizol-metoden til RNA-isolering, et spektrofotometer til RNA-koncentration, et cDNA-syntesesæt og qPCR med SYBR Green Master Mix28. I stedet for Turbo DNAfree-sættet DNAse, der henvises til i Elser et al., Brug et RNAcleanup-sæt efter Trizol RNA-isolationen for at sikre, at prøverne ikke indeholder forurenende stoffer28.
    BEMÆRK: Læs sikkerhedsdatabladet (MSDS) for Trizol, og brug det i en kemisk damphætte.
  3. Vurder plasmidindsættelsen af kontrolplasmidet med GFP-primere og af det eksperimentelle plasmid med BLAST-primere (primere opført i supplerende tabel 1). Brug CT-værdien til at bestemme tilstedeværelsen af plasmidet.
    BEMÆRK: CT-værdier over 35 er falske positive, og kun dem under 35 bør betragtes som en positiv indikator for, at plasmidet blev indsat med succes.
  4. Vurder IGF-1 placenta ekspression normaliseret til husholdning gen 18s (primere opført i supplerende tabel 1). Brug ddCT-metoden til at beregne foldændringen, og beregn derefter den normaliserede foldændring af forsøgsprøverne til den gennemsnitlige foldændring af kontrolprøverne.

7. Analyse af placentaproteinniveau

  1. Brug den fjerdedel af moderkagen, der har været opbevaret ved -80 °C. Homogeniser vævet i en bufferopløsning fremstillet af 11,5 mM Tris HCI, 5 mMMgCl2 og 10 mM proteasehæmmer i diH2O med en endelig pH på 7,4. Brug en håndholdt homogenisator og stød til at bryde vævet op.
    BEMÆRK: Prøven må ikke overstige 10% af bufferens volumen.
  2. De homogeniserede prøver fortyndes i bufferen ved 1:12, således at de ligger inden for det påviselige område for et BCA-sæt (bicinchoninsyreassay). Udfør BCA-analysen i henhold til producentens anvisninger, og kvantificer det samlede protein ved hjælp af en pladelæser.
  3. Efter udførelse af BCA-analysen normaliseres alle prøverne til den samme samlede proteinkoncentration på 2 mg / ml for IGF-1 ELISA, som gjort i Gumusoglu et al.29.
  4. Udfør IGF-1 ELISA i henhold til producentens anvisninger, og kvantificere IGF-1 protein niveauer med en pladelæser ved hjælp af en standard koncentrationskurve.

8. Rumlig CRIPSR-verifikation ved hjælp af fluorescerende in situ-hybridiseringsmærkning

  1. Når placentahalvdelene er blevet korrekt fastgjort i 4% PFA ved 4 °C i 1-3 dage, flyttes de til 20% saccharose ved 4 °C, før de fryses i optimal skæretemperatur (OCT) blanding.
  2. Serielt sektionerer de OCT-indlejrede placenta halvdele i en -20 ° C kryostat i 10 μm sektioner og placerer dem på dias, der skal mærkes. Sektion placenta halvdele, så alle tre underregioner er synlige. Opbevar objektglassene ved -80 °C, indtil de bruges til in situ-hybridisering .
  3. Udfør fluorescens in situ hybridisering (FISH) mærkning efter producentens protokoller. Hybridiser et dias med en dCas9-3xNLS-VP64-sonde og et andet "søster" dias af samme placenta med en Prl8a8-sonde.
    BEMÆRK: dCas9-3xNLS-VP64-sonden registrerer tilstedeværelsen af det overekspressive plasmid. Prl8a8-sonden fremhæver spongiotrophoblaster i forbindelseszonen, hvilket gør det muligt at identificere underregionerne i moderkagen. Disse to sonder er mærket på separate "søster" dias for at undgå interferens af flerkanals fluorescens med den grønne autofluorescens i moderkagen.
  4. Mærk begge sonder med detektionsfarvestoffet (Opal 620). Når du har udfyldt producentens protokol for FISH, skal du anvende DAPI-monteringsmedium og placere et dæksel på diaset. Forsegl dæksedlen med klar neglelak.
  5. Billede diasene på et opretstående sammensat fluorescensmikroskop, og behandl dem ved hjælp af en passende billedbehandlingssoftware. Her blev CellSens-softwaren brugt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generelle procedureresultater (figur 6)
I undersøgelsen var der tre manipulerede grupper. Disse omfattede placentas injiceret med et generelt CRISPR Cas9 kontrolplasmid (Cas9 Control), et aktiveringskontrol CRISPR-plasmid (Act Control) eller et IGF-1 SAM-aktiveringsplasmid (Igf1-OE). Cas9 Control er bedre egnet til knockout-plasmider, og aktiveringskontrollen er bedre egnet til overekspression/aktiveringsplasmider. For at vurdere levedygtighedsændringer forårsaget af manipulation af moderkagen via injektion og elektroporation blev embryooverlevelse i kuldet analyseret på E14.5 (figur 6A). Dette tidspunkt blev valgt, da andre undersøgelser, der har udført in vivo-indsættelse af CRISPR-plasmider ved hjælp af elektroporation, har vist, at ekspressionsændringer kan opnås inden for 8-22 timer30,31,32. Indsamling ved E14.5 gør det muligt for CRISPR-plasmidet ca. 48 timer at integrere og aktivere en stigning i genekspression. Det blev konstateret, at kirurgisk manipulation af dæmningen påvirkede overlevelsen af alle embryonerne, men embryonerne forbundet med de manipulerede placentas, der gennemgik injektion og elektroporation, havde signifikant reduceret overlevelsen. Overlevelsesraten for de ubehandlede embryoner (i samme kuld, men uden målrettet manipulation) faldt fra 100 % overlevelse til gennemsnitligt 79,05 %. Der var et signifikant fald i overlevelsen af de manipulerede embryoner med en gennemsnitlig overlevelsesrate på 55,56%. Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel mellem de tre manipulerede grupper.

For at afgøre, om der forekom signifikante bruttoændringer i de manipulerede placentaer, blev placenta vægten registreret. Der var ingen signifikant forskel i nogen gruppes placentavægt (figur 6B), og moderkagens og embryoets bruttoudseende var uændret. Repræsentative post-nekroskopibilleder blev taget på et dissektionsmikroskop ved indsamling på E14.5. Der blev taget billeder af moderkagen/fostre fra forskellige behandlingsgrupper, alle inden for samme kuld. Der var ingen mærkbar skade eller ændring i fænotypisk udseende i nogen behandlingsgrupper, hverken i fosterhinden eller det eksponerede embryo og dets tilsvarende placenta (figur 6D-I). Mens der ikke blev set nogen grove forskelle i morfologien af de manipulerede grupper ved brug af et IGF-1 aktiveringsplasmid, Dette kan ikke være tilfældet for andre eksperimentelle plasmider rettet mod andre gener, der mere væsentligt kan påvirke væsentlige vækst- og funktionsregulatorer af moderkagen eller embryoet. Der blev ikke fundet nogen forskelle i nogen måling mellem Cas9 Control og Act Control placentas. Derfor blev disse to grupper kombineret og omtalt som Con eller Controls for alle analyserne. Disse resultater viser, at manipulation af placentas in utero på E12.5 ved hjælp af denne teknik forårsager et fald i embryooverlevelse, men der er stadig betydelig levedygtighed. Resultaterne viser også, at placentavæksten generelt ikke påvirkes signifikant, da der ikke var nogen signifikant ændring i vægt mellem de manipulerede og ubehandlede placenta. Dette viser, at den foreslåede teknik kan muliggøre overlevelse af sunde og levedygtige CRISPR-manipulerede placentas og deres tilsvarende embryoner.

Ændring i moderens vægt blev registreret hver dag efter operationen før embryoopsamling på E14.5 (figur 6C). Operationen fandt sted på E12.5, så alle ændringer i moderens vægt er angivet i forhold til vægten på E12.5. De eksperimentelle (Exp) dæmninger gennemgik placenta manipulation, mens falske dæmninger gennemgik anæstesi og en laparotomi af tilsvarende varighed uden placenta manipulation. Mange drægtige moderdyr udviste et lille fald eller ingen vægtændring dagen efter indgrebet (E13.5); Dette skyldtes sandsynligvis forstyrret spisning under og kort efter operationen. De fleste dæmninger viste øget vægt på E14.5, men lejlighedsvis blev der stadig observeret et fald i vægt. Sporing af moderens modervægt efter operationen tillod overvågning af embryooverlevelse. Variationen mellem de drægtige moderdyrs vægt efter operationen var almindelig og indikerede ikke, at alle de behandlede embryoner var gået tabt. Der var ingen signifikante forskelle i vægtændringer efter operationen i humbug versus eksperimentelle dæmninger. Dette viser, at dæmningens trivsel generelt blev bevaret efter indsættelsen af CRISPR-plasmiderne i moderkagen. Samlet set viser dette, at selvom denne kirurgiske teknik kan forårsage et fald i embryonernes levedygtighed, giver den stadig en betydelig procentdel af sundt afkom, der kan bruges til undersøgelsen.

Analyse af ekspression og CRISPR-inkorporering i E14.5 placentas (figur 7)
For at afgøre, om den cellulære indsættelse af IGF-1-aktiveringsplasmidet var vellykket til overekspression af IGF-1, blev qPCR udført. Som forventet viste qPCR en signifikant stigning i IGF-1-ekspression i IGF1-OE-placentas versus kontrolplacentas når foldændringen blev normaliseret til 18s ekspression (Welchs t-test, p = 0,0302) (figur 7A). For at afgøre, om IGF-1 protein niveauer blev ændret, en ELISA blev udført på moderkagen fra alle grupperne. I overensstemmelse med qPCR viste ELISA-vurderingen af E14,5-placentas en signifikant stigning i IGF-1-proteinniveauerne i IGF1-OE-placentas versus kontrolplacentas (Welchs t-test, p = 0,0469) (figur 7B). qPCR og ELISA viste, at overekspressionsplasmidet med succes øgede henholdsvis IGF-1-genekspression og IGF-1-proteinproduktion.

For at sikre, at leveringen af plasmidet var specifik for de manipulerede placentaer, blev qPCR udført for det specifikke IGF-1 aktiveringsplasmid og CRISPR Cas9 Control plasmid. Disse qPCR'er blev udført på både de manipulerede placentas og de ubehandlede placentas, der stødte op til de injicerede. qPCR-primerne, der blev brugt til at vurdere aktiveringsplasmidekspressionen, målrettede mod en sekvens af BLAST-plasmidet, som er en del af aktiveringssystemet (figur 7C). De ubehandlede placentas viste ingen tilstedeværelse af BLAST-plasmidet (cyklustærskel [CT] ubestemt, mærket som 40 på grafen), og Igf1-OE-placentas viste en CT omkring 30. qPCR udført for at vurdere kontrolplasmidekspressionen målrettede en sekvens fra det indsatte GFP-gen (figur 7D). De ubehandlede placentas viste CT-værdier over 35, sandsynligvis forårsaget af primerdimerisering, da disse værdier ligger uden for et forventet ekspressionsområde. Kontrollerne viste en CT-værdi på ca. 30. Disse qPCR'er tjener som en kvalitetskontrol for at demonstrere den forventede overekspression af IGF-1 eller mangel derpå, og at plasmiderne kun er til stede i de forventede manipulerede placenta.

Rumlig verifikation af IGF-1 aktiveringsplasmidet blev udført under anvendelse af placentasektioner. Placentas, der var fastgjort og frosset i OCT-forbindelse, blev serielt snittet ved 10 μm på dias, så alle lagene var synlige. Objektglassene blev derefter frosset ved -80 °C, indtil de blev brugt til FISH-mærkning. For at kontrollere, hvor i moderkagen IGF-1 CRISPR-aktiveringsplasmidet blev inkorporeret, blev der anvendt en dCas9-3xNLS-VP64-sonde med rød fluorescerende mærkning. Denne sonde er rettet mod en funktionel komponent i aktiveringssystemet. Grøn autofluorescens blev brugt til at demonstrere underregionerne i placenta maternal-føtal grænsefladen (figur 7E, F). Der blev ikke påvist dCas9-3xNLS-VP64 i de ubehandlede placentaer, da de ikke var blevet behandlet med CRISPR-manipulation (figur 7E). Som forventet viste IGF1-OE placentas mærkning for dCas9-3xNLS-VP64, som det ses med rødt (figur 7F). CRISPR-inkorporering blev fundet i alle tre underregioner af moderkagen, med den klareste mærkning af forbindelseszonen (figur 7E). Fluorescensintensiteten af dCas9-3xNLS-VP64-mærkningen varierede på tværs af de plasmidbehandlede placentaer, hvilket indikerer, at nogle udtrykte plasmidet højere end andre, og der var variationer i den nøjagtige placering / omfang af mærkningen, men mærkning var generelt til stede i alle underregioner. For at bekræfte placeringen af dCas9-3xNLS-VP64-mærkningen blev Prl8a8 FISH-mærkning rettet mod spongiotroblaster udført for at mærke den midterste krydsende underregion (figur 7G, H). Dette blev udført i tilstødende sektioner fra samme placenta på et "søster" dias af de sektioner, der blev mærket til dCas9-3xNLS-VP64. Som forventet var strukturen angivet ved Prl8a8-mærkning ens mellem IGF1-OE og ubehandlede placenta. Decidua- og labyrintzonen kunne identificeres ved de blå kerner (DAPI) mærkning omkring den røde forbindelseszone (figur 7G, H). FISH-mærkningen af dCas9-3xNLS-VP64 præciserede, at plasmidet blev indsat i alle tre underregioner, og dette blev bekræftet med Prl8a8-mærkning. Resultaterne af FISH-mærkningen bekræftede, at inkorporeringen af IGF-1-aktiveringsplasmidet var vellykket, og plasmidet migrerede ikke ind i ubehandlede placentaer.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over protokollen . (A) Forenklet skematisk oversigt over det kirurgiske indgreb. Kronologisk rækkefølge af de vigtigste trin i teknikken. (B) Skematisk visning af et eksempel på manipuleret placenta afstand inden for livmoderhornene. Begge paneler blev oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Uterin laparotomi procedure. (A-B) Under kirurgisk forberedelse, (A) den barberede mave af en dæmning, og (B) det barberede område belagt med jodopløsning. (C-F) I operationsområdet, (C) et ~ 2 cm snit i mavehuden og (D) et ~ 2 cm snit i bughinden; tarmene er synlige. (E) Manipulation af livmoderhornene gennem snitstedet. Uterin horn er synlige. (F) Fuldstændigt eksponerede livmoderhorn anbragt på et sterilt kirurgisk afdækning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Injektion af CRISPR-plasmider i E12,5 placenta. (A,B) Embryoners og placentas orientering i livmoderhornene. (A) Skråt billede af et mærket livmoderhorn, der viser decidua, fosterzoner og et embryo. Den stiplede linje repræsenterer, hvor injektionsstedet skal være. (B) Et umærket livmoderhorn fra panel A. (C,D) Set fra siden af mikropipetten indsat i injektionsstedet i moderkagen. D er decidua, FZ er fosterzonerne, E er embryoet, og den stiplede linje repræsenterer injektionsstedets placering. (D) Umærket billede af indsættelsen af mikropipetten fra panel C. (E,F) Set fra siden af farvestoffet i moderkagen efter injektion. (E) Mærket billede af et livmoderhorn, der viser en moderkage, der er blevet injiceret med et CRIPSR-plasmid, der indeholder et synligt farvestof og en moderkage, der ikke er injiceret. (F) Umærket billede af livmoderhornet i panel E. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Elektroporation af E12,5 placentas efter injektion af CRISPR-plasmider. (A) Set ovenfra af moderkager i et livmoderhorn. Anode- og katodeelektroporationspadlerne er mærket, og den hvide pil angiver placeringen af injektionsstedet. B) Skråt billede af elektroporationen af en moderkage. C) Set fra siden af elektroporationen af en moderkage. (D-F) Forenklet oversigt over panelerne A, B og C. Anode- og katodepadlerne er mærket, P er moderkagen, E er embryoet, og det umærkede område er livmoderen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Suturering af mavehud og bughinde . (A) Uterin horn vendte tilbage til maven efter afslutningen af operationen. Abdominal hud og peritoneum snit er synlige. (B) Peritoneum snit fuldstændigt sutureret. (C) Abdominal hudsnit fuldstændigt sutureret. (D) Påføring af vævslim på abdominale hudsuturer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Generelle procedureresultater. (A) Embryooverlevelsesrater efter operationen indsamlet på E14.5, 2 dage efter proceduren. Et signifikant fald i overlevelse blev observeret i de manipulerede grupper versus de ubehandlede embryoner (Mann-Whitney U-test: Ubehandlet vs. Cas9 Control, p = 0,0077; Ubehandlet vs. aktkontrol, p = 0,0330; og ubehandlet vs. IGF1-OE, p = 0,0032). Der blev ikke observeret signifikante forskelle i overlevelsen af de manipulerede grupper (envejs ANOVA, p = 0,9454). Hvert punkt repræsenterer overlevelsesprocenten fra et enkelt kuld (Ubehandlet n = 22, Cas9 Control n = 9, Act Control n = 13 og IGF1-OE n = 22 kuld). (B) Placentavægten af de overlevende embryoner på E14.5 (envejs ANOVA, p = 0,1436) (Ubehandlet n = 138, Cas9 Control n = 15, Act Control n = 20 og IGF1-OE n = 36 placentas). (C) Ændring i moderens vægt efter operationen på E13.5 og E14.5 set hos moderdyr, der gennemgik en falsk laparotomiprocedure eller gennemgik eksperimentel (Exp) placentamanipulation. Der ses ingen signifikant forskel mellem de to grupper af moderdyrs vægtændringer efter operationen (Uparrede t-tests: E13,5 p = 0,5452 og E14,5 p = 0,2493) (Sham dæmninger n = 3 og Exp dæmninger n = 10). Alle fejlbjælker repræsenterer SEM. (D-F) Billeder af E14.5-embryoner efter nekroskopi i fosterhinden med moderkagen stadig fastgjort. (F) Skalabjælken i det yderste højre hjørne repræsenterer 3,75 mm. (G-I) Skråt billede af embryoet og set ovenfra af den tilsvarende moderkage. (I) Skalabjælken i det yderste højre hjørne repræsenterer 3,75 mm. (D-I) Alle behandlingsgruppeetiketterne er angivet under billederne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Analyse af ekspression og CRISPR-inkorporering i E14.5 placentas. (A) qPCR-analyse af IGF-1-ekspression i E14.5-kontrol og IGF1-OE-placenta. En signifikant stigning i IGF-1 ekspression normaliseret til 18s ekspression blev observeret i IGF1-OE placentas (Welchs t-test, p = 0,0302) (Control n = 15 og IGF1-OE n = 20 placentas). (B) ELISA af IGF-1 proteinniveauer i E14.5 kontrol og IGF1-OE placentas. En signifikant stigning i IGF-1 niveauer blev observeret i IGF1-OE placentas sammenlignet med kontrolniveauer (Welchs t-test, p = 0,0469) (Control n = 13 og IGF1-OE n = 15 placentas.) (C) qPCR-analyse af BLAST-sekvens fra IGF-1 SAM-plasmidet. Ekspressionen af BLAST blev kun fundet i IGF1-OE placentas, og ingen/ubestemt ekspression blev fundet i de ubehandlede placentas (Ubehandlet n = 4 og IGF1-OE n = 9 placentas). D) qPCR-analyse af GFP-sekvensen fra CRISPR Cas9-kontrolplasmidet. Ekspression af plasmidet blev fundet i kontrolplacentas og CT-værdier over 35/falsk positive resultater blev fundet i de ubehandlede prøver (Ubehandlet n = 4 og Control = 5 placentas). Den stiplede linje repræsenterer tærsklen for falsk positiv ved 35 CT. Hvert datapunkt er fra en moderkage. Alle fejlbjælker repræsenterer SEM. (E-H) Fluorescens in situ hybridisering af E14.5 placentasektioner ved 10 μm tykkelse. (E) Ubehandlede og (F) IGF1-OE placenta sektioner med en dCas9-3xNLS-VP64 sonde mærket med rødt. Det røde signal er kun til stede i IGF1-OE placenta. Det grønne signal er autofluorescens, der bruges til at hjælpe med at identificere placentaunderregionerne. (G) Ubehandlede og (H) IGF1-OE placenta sektioner med en Prl8a8 sonde mærket med rødt for at identificere spongiotrofoblaster i den midterste krydszone. DAPI i blåt viser decidua- og labyrintzonerne, der omgiver den krydsende zone. (H) Skalabjælken i det yderste højre hjørne repræsenterer 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel 1: Primere anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Placenta er en primær regulator af fostrets vækst, og som tidligere nævnt kan ændringer i placenta genekspression eller funktion påvirke fostrets udviklingbetydeligt 6. Den her skitserede protokol kan bruges til at udføre en målrettet in vivo CRISPR-manipulation af musemoderkagen ved hjælp af en relativt avanceret kirurgisk tilgang. Denne teknik giver mulighed for et betydeligt udbytte af levedygtige embryoner og deres tilsvarende placentas, der kan bruges til yderligere undersøgelse (figur 6A, B). Denne teknik tillod os med succes at overudtrykke placenta IGF-1 på E14.5 (figur 7A, B). De anvendte plasmider viste specificitet, da de indsatte plasmider forblev i de manipulerede placentas og ikke var til stede i de tilstødende ubehandlede placentas (figur 7C,D). Den rumlige fordeling af IGF-1-aktiveringsplasmidet blev bekræftet af FISH for dCas9-3xNLS-VP64 og Prl8a8, hvilket viste, at aktiveringsplasmidet var til stede i de tre underregioner af IGF1-OE-placentas og ikke i nogen underregioner af de ubehandlede placentas (figur 7E-H). Denne teknik kan bruges til at ændre placenta genekspression på måder, som måske ikke er mulige med tidligere teknikker. Anvendelsen af denne teknik vil give mulighed for en større forståelse af indflydelsen af placenta genekspression og funktion på fostrets udvikling i flere sammenhænge.

For at optimere succesen med denne procedure for moder- og fosterresultater blev virkningerne af at ændre flere parametre undersøgt, herunder injektions- og elektroporationsindstillingerne samt de anvendte materialer. For at øge dæmningens overlevelse og genopretning blev det konstateret, at tiden under anæstesi ikke skulle overstige 1 time, da længere operationsperioder signifikant reducerede overlevelsen. Hvis tiden under anæstesi når ca. 2 timer, reduceres sandsynligheden for overlevelse dramatisk til niveauer under 20%, sandsynligvis på grund af de negative virkninger af forlænget tid under isofluran. Bortset fra tiden under anæstesi var den mest almindelige komplikation ved kirurgi, der førte til moderens død, manglen på korrekt telt peritoneum, mens hud- og bughindesnittene blev foretaget. Hvis bughinden ikke er ordentligt teltet, kan tarmene blive skadet, hvilket kan forårsage død i dagene efter operationen. Den tid, livmoderen er eksponeret, påvirker også overlevelsen af dæmningen og embryonerne. Den gennemsnitlige tid, livmoderen blev udsat for vellykkede forsøg, var ca. 15 min; Over 30 minutters eksponering kan føre til øget resorptioner og mulig modersygdom. Den udsatte livmoder og andre udsatte organer (ofte tarmene) skal holdes fugtige, men for meget saltvand kan afkøle dyret; Ved periodisk fugtning af de udsatte organer bør der anvendes mindre end 1 ml sterilt saltvand.

Parametrene for injektion og elektroporation påvirkede i høj grad embryooverlevelsen. Injektionsvolumenet bør ikke overstige ca. 4,5 μl, da dette resulterede i resorptioner. Injektionstiden og trykket er vigtige for at maksimere overlevelsen; Injektionstiden skulle indstilles mellem 0,5 s og 1,5 s, selvom 0,8 s syntes optimal. Trykket skal indstilles mellem 1-8,5 psi. Lave embryooverlevelsesrater blev set med lave injektionstider og høje injektions-PSI-niveauer. Det blev også observeret, at hvis mikropipetten var for stump, kunne der være et fald i embryonal levedygtighed, og opløsningen vil også ofte lække ud af mikropipetten. Den type farvestof, der bruges til at visualisere injektionerne, kan påvirke overlevelsen. Methylenblåt førte til moderens død, når det blev brugt til dette formål, men en filtreret Fast Green-farvestofopløsning viste ingen negative virkninger på moderens sundhed. Elektroporationsindstillingerne blev optimeret ud fra de anbefalede producentindstillinger baseret på tidligere elektroporationsstudier in vivo33. Elektroporation viste sig at være den manipulation, der forårsagede mest skade og nedsat embryooverlevelse. De anbefalede in vivo embryoelektroporationsindstillinger foreslår fire impulser for at maksimere CRISPR-effektiviteten, men to impulser anbefales for en højere overlevelsesrate33. Det blev konstateret, at fire impulser fik næsten alle embryonerne til at resorbere. To impulser muliggjorde øget levedygtighed, samtidig med at CRISPR-effektiviteten blev opretholdt. Størrelsen af elektroporationspadlen påvirkede også embryooverlevelsen betydeligt. Det blev konstateret, at 5 mm elektroporationspadler førte til næsten fuldstændig resorption, når de blev brugt med de anbefalede indstillinger. Faktisk anbefales 3 mm elektroporationspadler i producentens vejledning og øger embryoets levedygtighed betydeligt33. Det er også vigtigt at bemærke, at mange elektroporationspadler har visse pulsliv. Efter at de er blevet brugt til dette maksimum, kan der ses et fald i kvaliteten. Dette kan identificeres, hvis der ikke dannes et lille hvidt skum mellem padlerne og moderkagen under en puls. Elektroporationspadlespændingen kan kontrolleres ved hjælp af et voltmeter for at afgøre, om den producerer den forventede spænding.

Denne undersøgelse er begrænset på nogle få måder. Denne teknik er tidsspecifik og udføres sandsynligvis bedst tidligst E10.5 og senest E16.5. Dette skyldes, at moderkagen er for lille før E10.5, og efter E16.5 har plasmidet muligvis ikke tid nok til at producere den ønskede effekt. Denne tidsramme betyder, at denne teknik er bedre egnet til specifikke typer undersøgelser i mus. Denne teknik er nyttig til at studere neuroudvikling, da E12.5 falder inden for en afgørende tid for neurogenese for mange strukturer i hjernen34. Denne teknik er muligvis ikke nyttig til at studere placentapåvirkninger på de tidlige udviklingsstadier, såsom neural pladedannelse, som finder sted på E8.535. Resultaterne af et knockout CRISPR-plasmid kendes ikke på nuværende tidspunkt; Anvendelsen af denne metode til reduktion af genekspression kræver yderligere undersøgelse, da kun overekspression/aktivering af et gen er blevet påvist. På trods af dette forventes det, at denne teknik også vil være vellykket til indsættelse af et knockout CRISPR-plasmid.

Denne teknik kan også give mulighed for at udføre en primærkultur af genetisk modificeret placentavæv36. Afhængigt af hvilken type CRISPR der anvendes, såsom CRISPRi og CRISPRa, kan en primær kultur bruges til at udføre en redningsundersøgelse37,38. Denne teknik kan også bruges til yderligere at udforske forbindelser mellem placenta genetiske og funktionelle abnormiteter og problemer hos afkom. Specifikt fandt en tidligere undersøgelse en signifikant sammenhæng mellem placentaspecifikke genomiske risikoscorer og skizofrenirisici39. Denne undersøgelse identificerede mange placentagener, der kan spille en rolle i udviklingen af skizofreni, som ikke er blevet undersøgt i dyremodeller. Denne teknik egner sig til yderligere undersøgelser af denne type og andre.

Den viden, der opnås ved CRISPR-modifikation af moderkagen, kan omsættes til en række forskellige biomedicinske anvendelser. Undersøgelser, der identificerer, hvordan specifik genekspression i moderkagen kan påvirke fostrets udvikling, kan bruges til at skabe placentamålrettede farmakologiske interventioner, der kan behandle disse abnormiteter. Behandlinger rettet direkte mod et foster kan være vanskelige og farlige40,41. Placenta er et mere tilgængeligt mål for behandling. I tilfælde af udviklingsproblemer i hjertet eller hjernen, der kan ændres prænatalt, er direkte hjerte- eller hjernemanipulation høj risiko. En sådan risiko kunne undgås med placenta intervention, som er mere plausibel og kan føre til forebyggende strategier for neuroudviklingsforstyrrelser, for hvilke det molekylære miljø, som delvis tilvejebringes af moderkagen, kan være kritisk5. Denne teknik kan også bruges til behandling af sygdomme som medfødt hjertesygdom, som har været forbundet med placentaforstyrrelser9. Da medfødt hjertesygdom er en almindelig fødselsdefekt, kan muligheden for en placenta interventionsbehandling have en betydelig indvirkning8. Da moderkagen har mange funktioner, kan denne teknik bruges til at fremme udviklingen af interventioner for flere sygdomme. Samlet set kan denne placenta målrettede teknik bruges til at fremme forståelsen af indflydelsen af placenta genetik og funktion på flere områder af fostrets udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender følgende finansieringskilder: R01 MH122435, NIH T32GM008629 og NIH T32GM145441. Forfatterne takker Dr. Val Sheffield og Dr. Calvin Carters laboratorier ved University of Iowa for brugen af deres operationsrum og udstyr samt Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan og Dr. Matthew Weber for deres hjælp med mikroskopi. Forfatterne takker også Dr. Sara Maurer, Maya Evans og Sreelekha Kundu for deres hjælp med pilotoperationerne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD - Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 - 44 - 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60 Leica 3800160
Syringes BD - Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Tags

Genetik udgave 194 placenta mus CRISPR insulinlignende vækstfaktor 1 elektroporation overekspression udvikling
Mus <em>In vivo</em> placenta målrettet CRISPR-manipulation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carver, A. J., Taylor, R. J.,… More

Carver, A. J., Taylor, R. J., Stevens, H. E. Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation. J. Vis. Exp. (194), e64760, doi:10.3791/64760 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter