Summary
Dit protocol beschrijft het opzetten en uitvoeren van een micro-respirometriesysteem dat kan worden gebruikt om de fysiologische kenmerken van het koraalholobiont te onderzoeken.
Abstract
Metabolische activiteit, gedefinieerd als de som van organismale processen waarbij energie betrokken is, is van cruciaal belang voor het begrijpen van de functie en evolutie van het leven op aarde. Het meten van de stofwisseling van organismen staat daarom centraal bij het verklaren van de fysiologische toestanden van organismen, hun ecologische rol en de impact van veranderingen in het milieu op soorten binnen terrestrische en aquatische ecosystemen. Op koraalriffen zijn metingen van het metabolisme gebruikt om de symbiosewerking tussen koralen en hun obligate algensymbionten (Symbiodiniaceae) te kwantificeren, en om te beoordelen hoe omgevingsstressoren, waaronder klimaatverandering, de gezondheid van koraal zullen beïnvloeden. Ondanks dit belang is er een gebrek aan methoden, en dus gegevens, met betrekking tot metabolische snelheidsmetingen bij koraalnakomelingen, waarschijnlijk vanwege hun kleine omvang. Om deze kloof te dichten, had deze studie tot doel een aangepaste opstelling te ontwikkelen voor het meten van de ademhaling van kleine (millimetergroottebereik) ecologieën van zeedieren. Deze lage kosten en eenvoudige installatie zouden een betere meting van de stofwisseling mogelijk moeten maken. Dit zal essentieel zijn voor toegepast ecologisch onderzoek waarbij gebruik wordt gemaakt van de seksuele productie van koralen voor rifherstel.
Introduction
Ademhaling is een kritische biologische meting die de algehele metabolische activiteit van een organisme signaleert, maar net als andere kritische eigenschappen (groei) moeilijk te meten is in kleine organismen. Ademhaling kan worden gedefinieerd als de oxidatie van organische moleculen door het gebruik van zuurstof. Dit proces genereert de chemische energie die nodig is voor de cellulaire functie (d.w.z. metabolisme), wat essentieel is voor het overleven van organismen. Als alternatief resulteert anaëroob metabolisme in zuurstofschuld2. Ademhalingsfrequenties kunnen worden bepaald met behulp van optoden die het gebruik (en dus de afname) van de zuurstofconcentratie in de loop van de tijd meten in een gesloten kamer, een praktijk die algemeen bekend staat als respirometrie3. Aangezien de meeste organismen geen zuurstof opslaan, kan de snelheid van het metabolisme worden afgeleid uit de directe correlatie tussen ademhaling en koolstofgebruik. Hierdoor kan de ademhalingsfrequentie worden omgezet in dagelijks koolstofgebruik, wat kritieke metabolische functies zoals groei, voortplanting en het vermogen om metabole homeostase te handhaven informeert in tijden van omgevingsstress 4,5, inclusief hittegolfomstandigheden die over het algemeen leiden tot stress of verbleking bij koralen.
Koraalriffen nemen wereldwijd in een steeds sneller tempo af. Het koraaldier herbergt een consortium van partners (waaronder dinoflagellaat Symbiodiniaceae, schimmels, bacteriën en virussen), gezamenlijk aangeduid als de "holobiont"6. Naarmate de oceaantemperaturen stijgen, staan koralen, en dus koraalriffen, onder toenemende druk om te overleven, aangezien hoge temperaturen leiden tot het verlies van het dinoflagellaat Symbiodiniaceae (hierna symbionten), een fenomeen dat bekend staat als bleking7. Veel voedingsstoffen zijn anders niet beschikbaar voor koralen in oligotrofe tropische wateren, waaronder anorganische stikstof en fosfor8. Om het hoofd te bieden, vormen koralen een obligate voedingssymbiose met hun dinoflagellaatsymbionten (Symbiodiniaceae), die het grootste deel van de voedingsstoffen leveren die de koraalgastheer nodig heeft om te overleven en hun calciumcarbonaatskeletten af te zetten9. Een functionerende symbiose kan worden gekenmerkt door een hoge mate van koolstofdeling tussen partners10,11, en de regulatie van symbiose omvat een dynamische homeostase12.
Tijdens hittestress worden deze dynamische regulatie en communicatie verstoord, wat resulteert in dysbiose en bleken (besproken in referentie13). Metabole metingen, zoals fotosynthese en ademhaling, hebben daarom het potentieel om zowel de gezonde als de ongereguleerde, dysbiotische toestanden van koralen op te helderen, en het nauwkeurig meten van deze processen in de ontogenie is van cruciaal belang voor het begrijpen van het functioneren van organismen. Dit is vooral belangrijk omdat de frequentie en omvang van massale bleekgebeurtenissen toenemen, met het potentieel om veranderingen in het delen van voedingsstoffen van de symbionten te beïnvloeden, waarbij is vastgesteld dat de koolstofoverdracht afneemt naarmate de temperatuurstijgt14. Dit kan te wijten zijn aan gestuurde mechanismen door de symbiont die voedingsstoffen vastlegt of aan hard-fysiologische afwegingen (verhoogde thermische tolerantie maar een afname van de overleving van de gastheer 15,16,17). Verstoringen in symbiose kunnen het gevolg zijn van zowel de symbiont als de gastheer, hoewel een leidende factor waarschijnlijk het cellulaire disfunctioneren van de symbiont is18. Stress veroorzaakt door stijgingen van de zeewatertemperatuur destabiliseert deze symbiose echter; Het delen van koolstof van symbiont tot gastheer wordt verminderd met19,20 en verhongering van het koraal kan het gevolg zijn. Dit kan worden weerspiegeld in verminderde lipiden- en koolhydraatvoorraden in koralen als gevolg van een verhoogd gebruik van de gastheer ("verhoogd katabolisme van vaste koolstof"), waarschijnlijk als gevolg van verminderd delen door symbionten11. Naast de bijdrage van fotosynthese en ademhaling van de symbionten van de koralen, is de ademhaling van het koraaldier een belangrijke maatstaf om de gezondheid van het koraal, de effecten van verbleking en de uitwisseling van voedingsstoffen tussen deze partners en de groei van de holobiont, een fenotype dat relevant is voor het overleven van veranderingen in het milieute begrijpen 8,21,22. Ten slotte, aangezien veel koralen symbiotisch zijn, is het gebruik van respirometrie om fotosynthese naast ademhaling te karakteriseren bijzonder nuttig voor het contextualiseren van P:R-verhoudingen en om te begrijpen of de symbiose stabiel is of niet (bijv. referentie23).
Veranderingen in het milieu veroorzaken daarom verschuivingen in de energiebudgetten van het koraal en zijn symbionten, wat leidt tot verschillen in groei14. Om het hoofd te bieden, kan de koraalgastheer de ademhaling en het gebruik van lipiden verhogen om aan de metabolische eisen te voldoen; Hittestress kan de netto productiviteit met 60% verminderen als gevolg van deze verhoogde ademhaling14, gemeten aan de hand van een verandering in opgeloste zuurstof. Symbiodiniaceae kunnen ook de stikstofassimilatie en koolstofretentie verhogen14,24, en deze reserves vervolgens gebruiken om energie te verschuiven naar hun eigen reparatie- en beschermingsmechanismen25,26. De balans van N en C is belangrijk voor het reguleren van de groei, en P in het bijzonder27, die zich kan manifesteren als een dynamische regulatie van symbionten. Inderdaad, bewijs verzameld van koralen over grote rifvlakten (>1.000 km) suggereert dat gastheren het vermogen hebben om symbiontengroei te beperken door de regulatie van P, hoewel dit per koraalsoort verschilt.
Alles bij elkaar genomen suggereren deze studies een winst van hittetolerantie met een gelijktijdige afname van de productie of translocatie van voedingsstoffen (d.w.z. de neiging tot symbiose) als gevolg van veranderingen in het milieu. Krachtige enkelvoudige juveniele methoden, zoals het kwantificeren van zuurstofgebruik via micro-respirometrie, moeten daarom worden gebruikt om de fundamentele mechanismen met betrekking tot het metabolisme te begrijpen en vervolgens worden toegepast op instandhoudingskwesties zoals het begrijpen van warmtetolerantieverwerving. Dit wordt hier gepresenteerd als een micro-respirometrie-instrument voor fysiologische metingen, bedoeld om de voedingsrelatie tussen koraaljuvenielen en hun algensymbionten te onderzoeken, maar geschikt voor andere kleine mariene organismen.
Het gebruik of de productie van zuurstof door organismen kan worden gemeten door ze in afzonderlijke, hermetisch afgesloten respirometriekamers of 'respirometers' (hierna "kamers" genoemd) te plaatsen, waar de zuurstofverandering wordt gemeten met behulp van optodes3. Optodes zijn sondes die de zuurstofconcentratie meten met behulp van lichtpulsen, en het loggen van metingen in de loop van de tijd maakt het mogelijk om ademhalings- en/of fotosynthesesnelheden te berekenen. In de praktijk is het meten van de ademhaling vergelijkbaar met het meten van fotosynthese in koralen, behalve dat de koralen in totale duisternis worden geïncubeerd. Het aftrekken van de totale dagelijkse ademhaling van het koraal en de symbionten van de totale dagelijkse fotosynthese resulteert in een zuurstofverschil (zuurstofdelta)2,3. Over het algemeen gebruiken organismen meer zuurstof dan ze produceren, wat resulteert in een tekort. Dit kan worden omgerekend naar koolstofequivalenten, aangezien zuurstof en koolstof in een vaste verhouding2 worden verbruikt. Het koolstofoverschot kan door het koraal worden gebruikt voor groei, slijmsynthese en -voortplanting, en andere essentiële metabolischebehoeften12.
Dit protocol beschrijft een micro-respiratiemethode (Figuur 1) die werd gebruikt voor het meten van de ademhalingssnelheid (R) voor individuele koraaljuvenielen met behulp van een op maat gemaakt 1,5 ml glazen kamerontwerp (flacon met GL25-schroefdraad en 20 mm hoog, met bult/nok, platgeslepen rand en schroefdop met gat; zie Tabel met materialen) gevuld met 0,5 μm gefilterd zeewater. Glasvezeloptoden (zie Materiaaltabel) werden in elke kamer ingebracht via een gat in de zijkant van het deksel. Elk individueel koraal werd bevestigd boven een hard gaas, doorstroomroerplaatplatform boven een magnetische roerstaaf om een adequate menging van water in de kamer te garanderen. In het representatieve voorbeeld hier werden twee controles of "blanco's" (kamers die identiek waren, behalve de aanwezigheid van het monster) gelijktijdig gemeten met de drie gerepliceerde monsterkamers, omdat we meerdere controllers tegelijkertijd hadden draaien. Het installatievoorbeeld (Figuur 2) toont echter alleen het gebruik van vier kanalen; Dit kan worden verhoogd met behulp van meerdere controllers en meerdere doorstroomstandaards. De temperatuur kan in dit systeem ook worden geregeld door elke kamer onder te dompelen in een op maat gemaakt waterbad met vooraf ingestelde watertemperaturen (27 °C voor controle of 31 °C voor de hoge temperatuurbelasting in de voorbeeldgegevens hier) met behulp van een recirculerend doorstroomsysteem (continue, zachte stroom ingesteld op 75 l/h). Het roerplaatplatform en de roerplaat met tandwielen kunnen elke grootte hebben en kunnen zo groot of zo klein worden gemaakt als nodig is om het aantal glazen kamers te huisvesten. In dit voorbeeld waren het platform en de plaat ongeveer 34 cm x 26 cm x 3 cm (Tabel met materialen). Kalibratie van de optodes werd vóór elke run uitgevoerd met behulp van twee standaardoplossingen die 0% en 100% zuurstofverzadiging vertegenwoordigen bij de juiste watertemperatuur en zoutgehalte voor deze experimentele setting.
Protocol
1. Opstelling van apparatuur en koralen in de ademhalingskamers
OPMERKING: Reproductief klare koralen (d.w.z. koralen met roze gepigmenteerde ei-/spermabundels die zichtbaar waren door gefragmenteerde vertakkingen van de soort Acropora tenuis-kolonies ) werden losgemaakt van het rif bij Magnetic Island (19° 6.249'S; 146° 51.728'E) op de dag van een volle maan in oktober 2018 (vergunningsnummer: G12/35236.1), verzameld en naar het laboratorium gebracht voor het paaien van koralen, waar juveniele koralen werden gekweekt en gekweekt.
- Verbind op de dag van de metingen de twee waterbadplaten met behulp van blauwe polypipe en connectoren (zie Tabel met materialen; Figuur 1 [5], Figuur 2A,B). Deze zullen dienen als incubatoren na aansluiting met de blauwe polypipe op de boiler/chiller. Zorg ervoor dat de motorplaat duidelijk zichtbaar is door de transparante waterbadplaten wanneer de respirometriekamers niet op hun plaats zitten.
- Sluit de twee slangen aan op de boiler/koelmachine (zie Materiaaltabel). Schakel de boiler/chiller in en stel vervolgens de gewenste experimentele temperatuur in (27 °C of 31 °C).
- Sluit de basis van het waterbad (stap 1.1) aan op de basismotorplaat met de magnetische tandwielen (Figuur 1 [6, 7] en Figuur 3A) en sluit dit geheel vervolgens aan op een stroombron (Figuur 3B). Schakel de stroombron in om de tandwielen te activeren, waardoor de roerstaven in de kamers worden geactiveerd.
- Moduleer de waterstroom naar behoefte (bijv. continue, zachte stroom ingesteld op 75 l/h met langzaam roeren bij 30 tpm) met behulp van de klepaansluitknoppen (Figuur 3C).
- Om de respirometriekamer in elkaar te zetten, voegt u de magnetische kraal (Figuur 1 [1.5]) toe aan de glazen kamer (Figuur 1 [1.6]) en vervolgens de ondoorzichtige plastic doorstroomstandaard (Figuur 1 [1.4]) in de glazen kamer (Figuur 4A). De grootte van de kamer en de magnetische kraal hangt af van het organisme en het studiesysteem van belang.
NOTITIE: Er zijn gaten in de plastic basis om waterstroom en circulatie mogelijk te maken door de beweging van de magnetische kraal in de bodem. - Lijm het koraal met aquariumlijm (zie Materiaaltabel) op de zwarte kabelbinder die in de plastic basis is geplaatst (Figuur 4B-D). Om dit te doen, lijmt u eerst het koraaljuveniel op een stuk zwart plastic en lijmt u dit stuk vervolgens op de plastic basis. Zodra het koraal stevig is bevestigd (uitharding van de lijm is bijna onmiddellijk), schroeft u het deksel met de O-ring (Figuur 4A) op de glazen kamer. Voer deze acties onder water uit in een apart bassin om er zeker van te zijn dat er geen lucht in de respirometriekamer zit.
NOTITIE: Het watervolume in de respirometer (d.w.z. effectief volume = 1.5 ml) werd bepaald door de kamer volledig onder water te dompelen. De aanname is dat, ten opzichte van het watervolume, de verplaatsing van de massa/dichtheid van het zeer kleine koraal verwaarloosbaar is. De microcentrifugebuis van 1,5 ml is hier afgebeeld voor schaal (Figuur 4A). - Plaats de kamers stevig in de waterbaden (Figuur 5A). Zorg ervoor dat de glazen kamers in contact staan met het temperatuurgeregelde water voor het experiment.
- Sluit de O2 glasvezelkabels (zie Materiaaltabel) aan zodat ze in contact komen met de zuurstofsensorspots (hierna spots genoemd; zie Materiaaltabel) door ze in het gat te steken dat in de zijkant van de dekselkamers is geboord. Deze kleine spots zijn zuurstofgevoelig en detecteren en verzenden het signaal vanuit de kamer via de glasvezelkabel.
- Voeg sanitairtape (witte dunne zelfklevende tape) toe om de kabel goed te laten passen en stevig in de waterkamer te laten blijven. Zorg ervoor dat het individuele koraal te zien is (zoals te zien is in Figuur 5B), met bruine tentakels naar boven gericht, in de kamer (Figuur 5B, Video 1).
OPMERKING: Kostenramingen van de componenten in het apparaat zijn te vinden in tabel 1.
- Voeg sanitairtape (witte dunne zelfklevende tape) toe om de kabel goed te laten passen en stevig in de waterkamer te laten blijven. Zorg ervoor dat het individuele koraal te zien is (zoals te zien is in Figuur 5B), met bruine tentakels naar boven gericht, in de kamer (Figuur 5B, Video 1).
2. Standaardprocedure voor het meten van de ademhaling met behulp van het O2-systeem
- Open de zuurstofmeetsoftware (zie Materiaaltabel).
- Meet de temperatuur van de ruimte waar de kalibratie zal worden uitgevoerd. Dit is later nodig voor de kalibratiefase (stap 2.8).
- Monteer de optische sensoren en doppen. Sluit hiervoor alle glasvezel aan op de bijpassende poort in de O2-module . Zorg ervoor dat dop 1 overeenkomt met sensor 1, dop 2 met sensor 2, enzovoort.
- Om de kamers in te stellen voor kalibratie, bevochtigt u eerst een stuk schone spons met een beetje water met omgekeerde osmose (RO) en steekt u dit in elke kamer.
NOTITIE: De spons mag niet druppelen, alleen vochtig zijn. Het kan op de glasvezelplek druppelen. Zorg ervoor dat de plek niet nat is voordat u doorgaat naar de volgende stap. - Plaats de kamers ondersteboven met de bijpassende glasvezel (Figuur 6). Hierdoor kan de kamer worden losgeschroefd zonder de glasvezel aan te raken en het natriumsulfiet toe te voegen voor de 0%-kalibratie.
- Controleer het signaal van elke sensor voor het begin van de kalibratie. Doorloop alle tabbladen in de software-interface en controleer de signaalwaarde (linkerbovenhoek) (Figuur 7A), waarbij u ervoor zorgt dat ze niet significant variëren. Raadpleeg de handleiding O2 voor de aanvaardbare waarden voor de experimentele opstelling (afhankelijk van het organisme en de omstandigheden van belang). Voor deze specifieke opstelling is bij een kamertemperatuur van 25,3 °C een FTC (oxygen sensor spot flow through cell normal range) van 20,59 met een signaal van 179,5 acceptabel.
- Open Program en controleer de instellingen in de software om te bevestigen dat ze correct zijn, zoals hieronder beschreven. Als het pop-upvenster niet onmiddellijk na het openen van het programma verschijnt, kan dit worden gedaan door op de knop Instellingen in de linkerbenedenhoek van de software-interface te klikken.
- Controleer of de externe temperatuursensor is geactiveerd (Figuur 7B). Wijzig de instelling in Vaste temperatuur (Figuur 7C). Voeg vervolgens de waarde van de kamertemperatuur toe en klik op instelling kopiëren naar alle andere kanalen.
- Wijzig de instelling om signaaldrift te verminderen (Figuur 7C). Selecteer vervolgens Sensorinstellingen en selecteer niveau 2. Anders zal bij gebruik van kleine volumes de drift zo hoog zijn dat het moeilijk te kalibreren zal zijn.
- Controleer de algemene instellingen van de zenders. Druk op OK indien voldoende. Klik op instellingen kopiëren naar alle kanalen en klik vervolgens op ok.
- Kalibreer de sensoren. Ga voor kanaal 1-kalibratie naar het tabblad Kanaal 1 en druk op de knop Kalibreren . Selecteer 2-punts in water of vochtige lucht.
- Voor de "lucht"-kalibratie dompelt u een stuk schuim in water, plaatst u het in de kamer en wacht u tot het signaal is gestabiliseerd (zie de afbeeldingen voor en na de luchtkalibratie). Als het stabiel is, drukt u op "lucht instellen". Klik op lucht > Kalibreren > lucht instellen.
- Stel de 0%- en 100%-kalibratie in (Figuur 7D). Verwijder de kamer van de dop en plaats deze in de volgende dop zodat het luchtkalibratiesignaal klaar is wanneer de 0%-kalibratie in de eerste sensor is voltooid. Gebruik een transferpipet en vul de dop met 2% natriumsulfiet. Wacht tot het signaal is gestabiliseerd.
NOTITIE: Het signaal heeft meestal meer tijd nodig om te stabiliseren in vergelijking met de luchtkalibratie. Als er een waarschuwingsbericht verschijnt dat zegt dat de "waarden buiten het normale bereik liggen", zorg er dan voor dat het natriumsulfiet vers is. Herhaal hetzelfde kalibratieproces voor alle kanalen. Bereid het natriumsulfiet door 2 g toe te voegen aan 100 ml RO-water. - Zodra de kalibratie is voltooid, spoelt u de ademhalingskamers goed af en droogt u de kamers en doppen. Zorg ervoor dat er geen water in het glasvezelgat zit.
- Plaats het organisme (enkele koraaljuvenielen, in dit voorbeeld) in de ademhalingskamers en sluit af met deksels. Zorg er bij het plaatsen van de deksels voor dat u dit doet wanneer de kamers volledig zijn ondergedompeld en er absoluut geen lucht in zit.
- Plaats de kamers stevig in de roerplaat en sluit de glasvezel aan.
- Schakel de voeding in. Zorg ervoor dat het water in de kamers volledig wordt gemengd. Stel de temperatuur in de koelmachine/verwarming in op de gekozen experimentele temperaturen.
- Zet de pomp en de kachel aan (stap 1.2 en 1.4).
- Druk op log op de O2-meetsoftware-interface om de opname te starten.
Representative Results
Gegevensverwerking en -analyse
Hoewel er tal van methoden zijn om de ruwe gegevens van respirometrie-experimenten te verwerken, wordt aanbevolen om het R-pakket respR28 te gebruiken. In overeenstemming met het delen van de bovenstaande protocollen, die pleiten voor open wetenschap en reproduceerbaarheid, maakt dit pakket het mogelijk om gegevensverwerking en -analyse in een gemakkelijk reproduceerbare vorm te delen en is het ontworpen met dat in gedachten. Het is een gratis, open-source platform en probe-systeem agnostisch, en eenvoudig te installeren vanuit CRAN of GitHub. De volledige code en voorbeelden voor respR worden bijgehouden en zijn te vinden op https://github.com/januarharianto/respR.
Het respR-pakket heeft functies voor het importeren, visualiseren en uitvoeren van kwaliteitscontrole op respirometriegegevens, en voor het automatisch berekenen van ademhalingsfrequenties of uit handmatig gekozen regio's. Het kan ook de snelheden voor achtergrondademhaling en conversieratio's aanpassen aan veelgebruikte uitvoereenheden. De stappen om de gegevens van het micro-respirometriesysteem te verwerken, worden hieronder beschreven. In deze studie werden de gegevens van het respirometriesysteem als voorbeeld gebruikt, maar het pakket accepteert ook invoer van de meeste in de handel verkrijgbare zuurstofsondesystemen en generieke R-gegevensobjecten. Meer details over het pakket, inclusief volledige documentatie en tutorials, zijn te vinden op de website van het pakket op https://januarharianto.github.io/respR/index.html.
Onbewerkte gegevens importeren
Het RAW-uitvoerbestand (.txt) wordt geïmporteerd. respR herkent het formaat en parseert het tot een generiek R-gegevensframe dat in volgende functies kan worden gebruikt. Het is echter belangrijk op te merken dat dit optioneel is; deze bestanden en vrijwel alle zuurstoftijdreeksgegevens kunnen ook worden geïmporteerd met behulp van basisfuncties (hieronder weergegeven) door iedereen met een basiskennis van R.
#load respR
Bibliotheek(respR)
#Import ---
Gegevens <- import_file ("file.txt")
#Firesting-Pryo-bestand gedetecteerd
Inspecteren en visualiseren van de data
Een essentieel onderdeel van elke data-analysetaak is het plotten en inspecteren van de gegevens om te zoeken naar duidelijke anomalieën of patronen, of zelfs om ze te helpen begrijpen. Hier wordt de inspectiefunctie gebruikt (Figuur 8A), die controleert op problemen die vaak voorkomen bij respirometriegegevens, zoals niet-numerieke of ontbrekende waarden.
#inspect een enkele zuurstofkolom
Insp <-inspect(gegevens, tijd = 3, zuurstof = 8, breedte = 0,2)
Deze functie zet ook de zuurstoftijdreeks in kaart en berekent een voortschrijdende snelheid (onderste paneel) om te helpen ophelderen hoe deze snelheid in de loop van het experiment kan veranderen. Deze voortschrijdende tariefgrafieken helpen te bepalen welke regio's van die tariefcurven moeten worden geëxtraheerd. In het geval van standaard- of routinematige stofwisselingssnelheden zijn de gewenste regio's die waar de snelheid stabiel is (bijv. na ongeveer tijdstip 3.000; Figuur 8B).
Hier wordt afnemende zuurstof pas detecteerbaar na ongeveer rij 200 in het volledige tijdreekspaneel. Patronen zoals deze komen veel voor in respirometriegegevens; Er is vaak een langere periode van instabiliteit aan het begin van een experiment als het systeem stabiliseert en het monster gewend raakt aan de experimentele omstandigheden. Het wordt aanbevolen om tarieven pas na deze aanvankelijke instabiliteit uit de tijdreeksen te halen, wat ook het belang van visualisaties benadrukt.
Tarieven extraheren
respR heeft twee functies voor het extraheren van ademhalingsfrequenties. De eerste is de calc_rate() functie, waarmee handmatig een snelheid kan worden geëxtraheerd door een tijdgebied, rij of zuurstofniveau op te geven. Dit is zeer gebruikelijk bij respirometrie-analyses en een volkomen aanvaardbare methode om een percentage te bepalen, zolang de selectiecriteria worden vastgesteld en consequent worden toegepast28.
Een robuustere en objectievere manier is het gebruik van de functie auto_rate(), die lineaire gebieden van de gegevens identificeert. Deze regio's zijn regio's met een constant aanhoudende ademhalingsfrequentie, die automatisch worden toegewezen met behulp van machine learning. Deze functie is ook nuttig voor de detectie van lage signalen (zoals in de monsters die in deze huidige studie zijn gebruikt, vanwege de lage biomassa op deze leeftijd). Deze functie maakt het mogelijk om de meest lineaire, minimum- en maximumtarieven te identificeren met behulp van onafhankelijke, objectieve en statistisch robuuste methoden28. In het voorbeeld hier wordt een lineair gebied geïdentificeerd dat zich voordoet rond tijdstippen 3.000 tot 5.000. Opgemerkt moet worden dat er meerdere lineaire regio's kunnen worden geïdentificeerd, maar deze sectie is de hoogst gerangschikte of meest lineaire regio (figuur 8C).
#Determine meest lineaire (d.w.z. consistente) snelheid
Tarief <-auto_rate(INSP)
Aanpassing van de achtergrond
Achtergrondsnelheden van controle-experimenten kunnen op dezelfde manier worden bepaald als in het bovenstaande voorbeeld, en kunnen worden gebruikt om de monstersnelheden aan te passen met behulp van de adjust_rate() functie (Figuur 9A; merk op dat hier niet de volledige analyse wordt weergegeven, alleen de aanpassing). Volledige voorbeelden zijn te vinden op de website van respR .
#Adjust tarief voor achtergrond
rate_adj <-adjust_rate(rate, by = bg) #saved bg-object
afdrukken(rate_adj)
Wisselkoersen omrekenen
De laatste stap is het converteren van de snelheden naar de gewenste uitvoereenheden, met behulp van de oorspronkelijke eenheden van de onbewerkte gegevens, het effectieve volume van de ademhalingsmeter en andere experimentele gegevens, inclusief het normaliseren naar blanco metingen (Figuur 9B). De output kan een absolute ademhalingsfrequentie zijn, dat wil zeggen van het hele monster, of een massa- of oppervlaktespecifieke snelheid. De oppervlaktespecifieke snelheid was de output die hier werd gebruikt, wat specifiek de absolute snelheid is gedeeld door de oppervlakte van het monster (figuur 9C).
Zoals hierboven besproken, is dit systeem ontwikkeld om zeer kleine monsters te meten. Daarom verwachtten we lage waarden en mogelijke overlap met blanco metingen. Er wordt een bepaald signaalniveau verwacht binnen de blanco's, en wanneer ze worden onderzocht, liggen deze waarden binnen het verwachte bereik van algemene experimentele ruis, mogelijk als gevolg van sondedrift, lichte temperatuurveranderingen of bellen op de sondes. Door het ontwerp en vanwege de kleine samplegrootte en dus het kleine effectieve volume dat wordt gebruikt, is het gebruik van blanco's hier bijzonder belangrijk, vooral voor elke run. Representatieve waarden zijn hier als voorbeeld opgenomen (figuur 10). Gezien de kleine grootte van het sample, raden we aan om bij elke run de blanco's te gebruiken om de metingen per run te standaardiseren.
Deze blancowaarden worden vervolgens gebruikt om de meetwaarden van de behandeling te standaardiseren. Aangezien koralen niet alleen zuurstof produceren, maar ook ademen, kan de stofwisseling variëren van negatieve tot positieve waarden. Hier wordt een voorbeeld gegeven van representatieve resultaten van het bereik van ademhalingswaarden die zijn gedetecteerd met het micro-ademhalingsinstrument. Deze resultaten zijn bepaald op basis van een succesvol experiment met enkele koraaljuvenielen (Figuur 10). Over het algemeen werd verwacht dat ademhaling moeilijk te detecteren zou zijn in deze voorbeelddataset (door ontwerp), gezien de kleine omvang van de monsters; Dit onderstreept de waarde van deze methode bij het vastleggen van deze lage signaaldrempel. Deze representatieve resultaten tonen ademhaling in het donker bij de kleinste geteste monstergroottes, wat de minimale detectiedrempel van dit systeem onderstreept. We hebben ook gemeten onder twee omstandigheden (controle en hoge temperatuurstress). Na standaardisatie naar de blanco's die per run werden gemeten, varieerden de waarden van bijna nul (controle) tot een mediaan van ~-5e-5 voor de stressbehandeling. Zoals verwacht was de ademhaling laag. Deze resultaten tonen duidelijk representatieve waarden voor blanco's, evenals een vergelijking tussen controle en hoge temperatuur voor deze zeer kleine monsters.
Figuur 1: Schematische weergave van de nieuwe micro-respirometrie-tool voor de fysiologische karakterisering van het koraalholobiont (koraaldier + symbionten) of elk klein organisme (<1 mm). Er werden aangepaste respirometriekamers gemaakt (nummer 1; 1.1-1.6). Deze omvatten deksels (1.1) met zuurstofsensorspots (1.2), en het individuele juveniel (1.3) wordt geplaatst op een doorstroomstandaard (1.4) bovenop een magnetische roerder (1.5), die allemaal in de glazen kamer (1.6) passen. De controller (2) wordt aan de spot bevestigd met een glasvezelkabel die in het deksel (1) past en aangesloten op de computer (3). De verwarming/koelmachine (4) wordt aangesloten op de respirometrieplaat (5) met het doorstroomwater (aangegeven door chevronpijlen voor richting), dat bovenop de roerplaat (6) met tandwielen (7) zit, aangedreven door de motor (8) en voeding (9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Micro-respirometrie setup. Er zijn meerdere opties beschikbaar, waaronder (A) één respirometrieplaat, of (B) aangesloten op meerdere platen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Op maat gemaakte magnetische roerplaat bovenop de respirometrieplaat. Elke kamer heeft (A) een magnetisch roerwerk aan de onderkant, (B) aangedreven door een motor, met (C) de respirometrieplaat die door middel van slangen is verbonden met de verwarming/koelmachine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 4: Aangepaste opstelling van de respirometriekamer. (A) Componenten (van links naar rechts: deksel, glazen flacon, standaard, 1,5 ml tube voor weegschaal en roerstaaf). (B) Individuele doorstroomstandaard waarin het monster zit. (C) Bovenaanzicht van de doorstroomstandaard. (D) en met de standaard in de glazen injectieflacon geplaatst met het deksel erop geschroefd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 5: Glazen injectieflacons geplaatst in de roerplaat. (A) Op maat gemaakte roerplaat met (B) een close-up van de complete glazen injectieflacon met de dekselopstelling. Het juveniele koraal is hier te zien door het deksel (bruine stip), bovenop de ritssluiting, met de glasvezel in de dekselopening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 6: Ondersteboven geplaatste kamers, klaar voor kalibratie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Afbeelding 7: Belangrijkste stappen in de zuurstofmeetsoftware. (A) Controleer het signaal van elke sensor. Een optimaal signaal voor dit onderzoek en de sensoren wordt weergegeven in de zuurstofsensorspot FTC (normaal bereik). (B) Controleer de signaaldrift. (C) Stel de behandelingstemperaturen in en controleer deze. (D) Stel de kalibraties van 0% en 100% in en controleer deze. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: respR-analyse output stappen I. (A) Inspecteer de opdracht en output. (B) Controleer de stabiliteit van de koers. (C) Bepaal het meest lineaire tarief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: respR-analyse outputstappen II. (A) Pas de snelheid aan voor de achtergrond, (B) Converteer en (C) controleer de tarieven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Representatieve resultaten van het micro-respirometrie-instrument. Mediane ademhaling (O2 ± standaardfout) van repliceren van individuele koraaljuvenielen, inclusief blancowaarden en ademhaling van individuen onder controle en stressomstandigheden bij hoge temperaturen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Bovenaanzicht van de respirometriekamer met het juveniele koraal erin tijdens een meetsessie. Klik hier om deze video te downloaden.
Tabel 1: Kostenramingen van onderdelen van het respirometrieapparaat. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Dit werk schetst de constructie van een op maat gemaakte micro-respirometrie-opstelling die kan worden gebruikt om de hoeveelheid zuurstof te kwantificeren die wordt verbruikt en geproduceerd door kleine sessiele waterorganismen. De kritische componenten van dit protocol omvatten de opstelling van de kamers, inclusief de spots, en de kalibratie van het lage signaal met behulp van het respR-pakket , waarin een laag signaal kan worden gedefinieerd als snelheden die worden gekenmerkt door ondiepe of luidruchtige hellingen. De aangepaste kamer en de opstelling ervan maken het mogelijk om zelfs lage signalen te detecteren, terwijl het gebruik van het R-pakket helpt beschermen tegen problemen waarbij het optreden van ondiepe of luidruchtige hellingen kan leiden tot een verkeerde interpretatie van de resultaten (bijv. vals-positieven).
Mogelijke aanpassingen die nodig zijn voor andere gebruikers zijn onder meer het vastzetten van het organisme van belang in de op maat gemaakte kamer. In dit geval werden een kleine, stijve ritssluiting en aquariumlijm gebruikt om het enkele juveniel aan de plastic basis te bevestigen, die vervolgens op de stropdas werd gelijmd. Opgemerkt moet worden dat voor dit experiment koraaljuvenielen werden neergezet op zwarte plastic zeilen. Dit plastic zorgde voor een gemakkelijke verwijdering van de koraaljuvenielen, die effectief van het plastic gleden, om ze tijdens het verwijderen niet fysiek te beschadigen. Jonge koraalplanten hechten zich aan het substraat waarop ze zich nestelen, dus het wordt aanbevolen om ze op vergelijkbaar plastic materiaal te laten rusten, met behulp van een kunstmatig peptide16 om hun verwijdering voor het lijmproces te vergemakkelijken. Om de hanteringsstress en de impact op de ademhalingsrespons verder te minimaliseren, wordt aanbevolen om de koralen die aan kabelbinders zijn gemonteerd 1-2 weken te laten acclimatiseren, zoals gebruikelijk is bij veel volwassen koraalstressexperimenten. Andere aanpassingen kunnen nodig zijn om het organisme boven de plek in het deksel te bevestigen en om watercirculatie mogelijk te maken. Een andere belangrijke stap voor het oplossen van problemen is signaaldetectie, met name op de helling van de zuurstoftijdreeks waar de snelheden moeten worden bepaald. Uiteindelijk komt dit neer op een combinatie van het gebruik van gezond verstand om duidelijk instabiele gegevens uit te sluiten, en de functies binnen respR om snelheden te extraheren uit consistent gekozen regio's of automatisch door lineaire regio's van de gegevens te identificeren. Verdere voorbeelden van hoe u dit kunt doen, zijn beschikbaar op de website van respR .
Deze methode is ontwikkeld om metingen van de ondergrens van de ademhaling uit te breiden tot extreem kleine, sessiele ongewervelde zeedieren. De voor de hand liggende beperking is dat dit protocol vatbaarder kan zijn voor vals-positieven in vergelijking met protocollen die zijn ontworpen voor grotere biomassa's. Aangezien dit echter het punt van het ontwerp was - om deze ondergrenzen te meten - is dit in het ontwerp meegenomen en kan de procedure worden gebruikt met het respR-pakket om beter te beschermen tegen vals-positieven. Het is ook belangrijk om te erkennen dat er andere systemen bestaan voor het meten van ademhaling30 en het meten van kleine organismen, waaronder respirometrie op individuele roeipootkreeftjes31 in kleinere volumes dan dit (~0,5-1 ml), maar die ofwel duur zijn of specifieke componenten missen (roervermogen). Dit systeem is echter open-source en relatief goedkoop in vergelijking met commerciële systemen (bijv. Core Microplate-systeem). Dit systeem omvat ook belangrijke methodologische overwegingen, zoals roeren, die andere systemen mogelijk niet hebben. De interne roerstaaffunctie is essentieel om de natuurlijke watermenging van veel mariene organismen (bijv. roeipootkreeftjes via zwemmen) na te bootsen, wat vaak niet mogelijk is en de gegevens grotendeels onbruikbaar kan maken. Andere beschikbare mengmethoden daarentegen zijn het plaatsen van de hele ademhalingsmeter op een gigantische tuimelbank, waarvoor extra apparatuur nodig is en beperkt succes is bij het mengen, of mengen via trillingen, wat verstoring van het organisme kan veroorzaken. Om deze reden is dit het enige systeem dat respirometrie kan uitvoeren op juveniele koralen of andere zeer kleine sessiele organismen. Ter referentie: het groottebereik van de hier opgenomen exemplaren varieerde van 2,1 tot 3,6 poliepen (overeenkomend met slechts een paar maanden oud), met een minimale tot maximale gemiddelde oppervlakte van 1,3 tot 4,5mm2.
Respirometrie is een fundamentele maatstaf in ecologische studies en er bestaan veel methoden voor dit doel. De meeste van deze bestaande methoden zijn echter gericht op monsters met een hoge biomassa, waaronder hele vissen, koraalfragmenten of zeegrassen 32,33,34. Deze methode is de eerste die gebruik maakt van individuele koraaljuvenielen. Bovendien zijn er veel potentiële toepassingen voor deze methode, omdat het belangrijke fysiologische informatie geeft over het functioneren van het organisme. Dit kan belangrijk zijn voor studies die de basisschattingen van de gezondheid willen karakteriseren35, inzicht willen krijgen in de rol van acute of langdurige stress tijdens koraalontogenie zoals hittestress36, of om drempels te bieden die managers kunnen instellen om de gezondheid van koraalriffen te helpen beschermen en verbeteren37. Gezien het feit dat het koraal een holobiont is en de symbiontengemeenschap in dit stadium en gedurende heteerste levensjaar relatief flexibel is, zou het interessant zijn om respirometriegegevens te koppelen aan veranderingen in gemeenschappen in de loop van de tijd, om het functioneren van het organisme als geheel volledig te contextualiseren. Belangrijk is dat deze methode bijdraagt aan 'open science'-technieken die helpen om een schets te geven voor het creëren van aangepaste experimentele opstellingen die openlijk kunnen worden gedeeld, verbeterd en gestandaardiseerd.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Sam Noonan bedanken voor zijn hulp en advies, Sven Uthicke voor het gebruik van de initiële respirometriekamers, Ben Shelab voor zijn technische illustratie en de workshop van het Australian Institute of Marine Science voor op maat gemaakte bewerking van respirometriekameradapters en -houders. De koralen werden verzameld onder de volgende vergunning van het Great Barrier Reef Marine Park voor AIMS G12/ 35236.1. Koralen hebben geen ethische vergunningen nodig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cost | |||
| (1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
| 1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
| 1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
| 1.3 individual organism | NA | NA | NA |
| 1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
| 1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
| 1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
| 2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
| 3 computer | NA | NA | NA |
| 4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
| 5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
| 6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
| 8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
| 9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
| Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
| Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
| Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
| Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |
References
- Quigley, K. M. A fast, precise, in-vivo method for micron-level 3D models of corals using dental scanners. Methods in Ecology and Evolution. 13 (10), 2159-2166 (2022).
- Svendsen, M. B. S., Bushnell, P. G., Steffensen, J. F. Design and setup of intermittent-flow respirometry system for aquatic organisms. Journal of Fish Biology. 88 (1), 26-50 (2016).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates: a Manual for Scientists. , Oxford University Press. (2018).
- Carey, N., Harianto, J., Byrne, M. Sea urchins in a high-CO2 world: partitioned effects of body size, ocean warming and acidification on metabolic rate. The Journal of Experimental Biology. 219 (Pt 8), 1178-1186 (2016).
- Clark, T. D., Sandblom, E., Jutfelt, F. Aerobic scope measurements of fishes in an era of climate change: respirometry, relevance and recommendations. The Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 15), 2771-2782 (2013).
- Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
- Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world's coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
- Morris, L. A., Voolstra, C. R., Quigley, K. M., Bourne, D. G., Bay, L. K. Nutrient availability and metabolism affect the stability of coral-symbiodiniaceae symbioses. Trends in Microbiology. 27 (8), 678-689 (2019).
- Yellowlees, D., Rees, T. A. V., Leggat, W. Metabolic interactions between algal symbionts and invertebrate hosts. Plant, Cell & Environment. 31 (5), 679-694 (2008).
- Rädecker, N., et al. Using Aiptasia as a model to study metabolic interactions in cnidarian-Symbiodinium symbioses. Frontiers in Physiology. 9, 214 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Davy, S. K., Allemand, D., Weis, V. M.
- Weis, V. M. Cellular mechanisms of Cnidarian bleaching: stress causes the collapse of symbiosis. The Journal of Experimental Biology. 211 (Pt 19), 3059-3066 (2008).
- Baker, D. M., Freeman, C. J., Wong, J. C. Y., Fogel, M. L., Knowlton, N. Climate change promotes parasitism in a coral symbiosis. The ISME Journal. 12 (3), 921-930 (2018).
- Chakravarti, L. J., van Oppen, M. J. H. Experimental evolution in coral photosymbionts as a tool to increase thermal tolerance. Frontiers in Marine Science. 5, 227 (2018).
- Quigley, K. M., Alvarez Roa, C., Beltran, V. H., Leggat, B., Willis, B. L. Experimental evolution of the coral algal endosymbiont, Cladocopium goreaui: lessons learnt across a decade of stress experiments to enhance coral heat tolerance. Restoration Ecology. 29 (3), e13342 (2021).
- Buerger, P., et al. Heat-evolved microalgal symbionts increase coral bleaching tolerance. Science Advances. 6 (20), eaba2498 (2020).
- Bieri, T., Onishi, M., Xiang, T., Grossman, A. R., Pringle, J. R. Relative contributions of various cellular mechanisms to loss of algae during cnidarian bleaching. PLoS One. 11 (4), e0152693 (2016).
- Tremblay, P., Gori, A., Maguer, J. F., Hoogenboom, M., Ferrier-Pagès, C. Heterotrophy promotes the re-establishment of photosynthate translocation in a symbiotic coral after heat stress. Scientific Reports. 6, 38112 (2016).
- Tremblay, P., Grover, R., Maguer, J. F., Hoogenboom, M., Ferrier-Pagès, C. Carbon translocation from symbiont to host depends on irradiance and food availability in the tropical coral Stylophora pistillata. Coral Reefs. 33 (1), 1-13 (2014).
- Wooldridge, S. A. Is the coral-algae symbiosis really 'mutually beneficial' for the partners. Bioessays. 32 (7), 615-625 (2010).
- Wooldridge, S. A. Breakdown of the coral-algae symbiosis: towards formalising a linkage between warm-water bleaching thresholds and the growth rate of the intracellular zooxanthellae. Biogeosciences. 10 (3), 1647-1658 (2013).
- Coles, S. L., Jokiel, P. L. Effects of temperature on photosynthesis and respiration in hermatypic corals. Marine Biology. 43, 209-216 (1977).
- Marubini, F., Davies, P. S. Nitrate increases zooxanthellae population density and reduces skeletogenesis in corals. Marine Biology. 127, 319-328 (1996).
- Iglesias-Prieto, R., Matta, J. L., Robins, W. A., Trench, R. K. Photosynthetic response to elevated temperature in the symbiotic dinoflagellate Symbiodinium microadriaticum in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10302-10305 (1992).
- Karako-Lampert, S., Katcoff, D. J., Achituv, Y., Dubinsky, Z., Stambler, N. Responses of Symbiodinium microadriaticum clade B to different environmental conditions. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 318 (1), 11-20 (2005).
- Blanckaert, A. C. A., Reef, R., Pandolfi, J. M., Lovelock, C. E. Variation in the elemental stoichiometry of the coral-zooxanthellae symbiosis. Coral Reefs. 39, 1071-1079 (2020).
- Harianto, J., Carey, N., Byrne, M. respR-An R package for the manipulation and analysis of respirometry data. Methods in Ecology and Evolution. 10 (6), 912-920 (2019).
- Gamble, S., Carton, A. G., Pirozzi, I. Open-top static respirometry is a reliable method to determine the routine metabolic rate of barramundi. Lates calcarifer. Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 47 (1), 19-28 (2014).
- Burford, B. P., et al. Rapid range expansion of a marine ectotherm reveals the demographic and ecological consequences of short-term variability in seawater temperature and dissolved oxygen. The American Naturalist. 199 (4), 523-550 (2022).
- Morozov, S., McCairns, R. J. S., Merilä, J. FishResp: R package and GUI application for analysis of aquatic respirometry data. Conservation Physiology. 7 (1), coz003 (2019).
- Leclercq, N., Gattuso, J. -P., Jaubert, J. Primary production, respiration, and calcification of a coral reef mesocosm under increased CO2 partial pressure. Limnology and Oceanography. 47 (2), 558-564 (2002).
- Anthony, K. R. N., Hoegh-Guldberg, O. Variation in coral photosynthesis, respiration and growth characteristics in contrasting light microhabitats: an analogue to plants in forest gaps and understoreys. Functional Ecology. 17, 246-259 (2003).
- Moulin, L., et al. Long-term mesocosms study of the effects of ocean acidification on growth and physiology of the sea urchin Echinometra mathaei. Marine Environmental Research. 103, 103-114 (2015).
- Quigley, K. M., Bay, L. K., van Oppen, M. J. H. Genome-wide SNP analysis reveals an increase in adaptive genetic variation through selective breeding of coral. Molecular Ecology. 29 (12), 2176-2188 (2020).
- Brunner, C. A., Ricardo, G. F., Uthicke, S., Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Effects of climate change and light limitation on coral recruits. Marine Ecology Progress Series. 690, 65-82 (2022).
- Quigley, K. M., Alvarez Roa, C., Torda, G., Bourne, D., Willis, B. L. Co-dynamics of Symbiodiniaceae and bacterial populations during the first year of symbiosis with Acropora tenuis juveniles. MicrobiologyOpen. 9 (2), e959 (2020).
- Quigley, K. M., Bay, L. K., Torda, G., Willis, B. L. Leveraging new knowledge of Symbiodinium community regulation in corals for conservation and reef restoration. Marine Ecology Progress Series, 600. , 245-253 (2018).
