Summary
Detta protokoll beskriver installationen och driften av ett mikrorespirometrisystem som kan användas för att undersöka de fysiologiska egenskaperna hos korallholobionten.
Abstract
Metabolisk aktivitet, definierad som summan av organismprocesser som involverar energi, är av avgörande betydelse för att förstå livets funktion och utveckling på jorden. Att mäta organismers ämnesomsättning är därför centralt för att förklara organismers fysiologiska tillstånd, deras ekologiska roller och effekterna av miljöförändringar på arter inom terrestra och akvatiska ekosystem. På korallrev har mått på ämnesomsättningen använts för att kvantifiera symbiosfunktionen mellan koraller och deras obligata algsymbionter (Symbiodiniaceae), samt bedöma hur miljöstressorer, inklusive klimatförändringar, kommer att påverka korallernas hälsa. Trots denna betydelse finns det en brist på metoder, och därmed data, som relaterar till metaboliska hastighetsmätningar hos korallavkommor, sannolikt på grund av deras ringa storlek. För att ta itu med denna lucka syftade denna studie till att utveckla en anpassad uppställning för att mäta respirationen hos små (millimeterstorleksintervall) marina djurekologier. Denna låga kostnad och enkla installation bör möjliggöra förbättrad mätning av ämnesomsättningen. Detta kommer att vara avgörande för tillämpad ekologisk forskning som utnyttjar sexuell produktion av koraller för restaurering av rev.
Introduction
Respiration är ett kritiskt biologiskt mått som signalerar den totala metaboliska aktiviteten hos en organism, men liksom andra kritiska egenskaper (tillväxt) är det svårt att mäta i småorganismer. Respiration kan definieras som oxidation av organiska molekyler genom användning av syre. Denna process genererar den kemiska energi som behövs för cellulär funktion (dvs. metabolism), vilket är avgörande för organismernas överlevnad. Alternativt resulterar anaerob metabolism i syreskuld2. Andningsfrekvensen kan bestämmas med hjälp av optoder som mäter användningen (och därmed minskningen) av syrekoncentrationen över tid i en sluten kammare, en metod som allmänt kallas respirometri3. Med tanke på att de flesta organismer inte lagrar syre kan ämnesomsättningen härledas genom den direkta korrelationen mellan andning och kolanvändning. På grund av detta kan andningshastigheten omvandlas till daglig kolanvändning, vilket informerar kritiska metaboliska funktioner som tillväxt, reproduktion och förmågan att upprätthålla metabolisk homeostas under tider av miljöstress 4,5, inklusive värmeböljor som i allmänhet leder till stress eller blekning hos koraller.
Korallreven minskar globalt i en allt snabbare takt. Koralldjuret hyser ett konsortium av partners (inklusive dinoflagellatsymbiodiniaceae, svampar, bakterier och virus), kollektivt kallade "holobiont"6. I takt med att havstemperaturerna stiger ökar trycket på korallerna, och därmed korallreven, att överleva, eftersom höga temperaturer leder till förlust av dinoflagellaten Symbiodiniaceae (hädanefter symbionter), ett fenomen som kallas blekning7. Många näringsämnen är annars otillgängliga för koraller i oligotrofa tropiska vatten, inklusive oorganiskt kväve och fosfor8. För att klara sig bildar koraller en obligatorisk näringssymbios med sina dinoflagellatsymbionter (Symbiodiniaceae), som ger majoriteten av de näringsämnen som korallvärden behöver för att överleva och deponera sina kalciumkarbonatskelett9. En fungerande symbios kan karakteriseras av höga nivåer av koldelning mellan partners10,11, och regleringen av symbios innebär en dynamisk homeostas12.
Under värmestress störs denna dynamiska reglering och kommunikation, vilket resulterar i dysbios och blekning (granskad i referens13). Metaboliska mätningar, såsom fotosyntes och andning, har därför potential att belysa både de friska och oreglerade, dysbiotiska tillstånden hos koraller, och att noggrant mäta dessa processer över ontogeni är avgörande för att förstå organismens funktion. Detta är särskilt viktigt eftersom frekvensen och omfattningen av massblekning ökar, med potential att påverka förändringar i näringsdelning från symbionterna, där kolöverföringen har visat sig minska när temperaturen ökar14. Detta kan bero på riktade mekanismer av symbionten som binder näringsämnen eller från hård-fysiologiska avvägningar (ökad termisk tolerans men en minskning av värdöverlevnaden 15,16,17). Störningar i symbiosen kan bero på både symbionten och värden, även om en ledande faktor sannolikt är att symbiont18 inte fungerar som de ska. Stress orsakad av ökade havsvattentemperaturer destabiliserar dock denna symbios; Koldelningen från Symbiont till värd minskar med 19,20 och svält av korallerna kan följa. Detta kan återspeglas i minskade lipid- och kolhydratdepåer i koraller på grund av ökad värdanvändning ("ökad katabolism av bundet kol"), sannolikt på grund av minskad delning av symbionter11. Vid sidan av fotosyntesen och andningen av korallernas symbionter är andning av koralldjuret ett viktigt mått för att förstå korallernas hälsa, effekterna av blekning och näringsutbyte mellan dessa partners och tillväxten av holobiont, en fenotyp som är relevant för att överleva miljöförändringar 8,21,22. Slutligen, med tanke på att många koraller är symbiotiska, är användningen av respirometri för att karakterisera fotosyntesen utöver respiration särskilt användbar för att kontextualisera P:R-förhållanden och förstå om symbiosen är stabil eller inte (t.ex. referens23).
Miljöförändringar orsakar därför förändringar i korallens och dess symbionters energibudgetar, vilket leder till skillnader i tillväxt14. För att klara sig kan korallvärden öka andningen och lipidanvändningen för att möta dess metaboliska krav; Värmestress kan minska nettoproduktiviteten med 60 % på grund av denna ökade andning14, mätt som en förändring i löst syre. Symbiodiniaceae kan också öka kväveassimileringen och kolbindningen14,24, och sedan använda dessa reserver för att flytta energi till sina egna reparations- och skyddsmekanismer25,26. Balansen mellan N och C är viktig för att reglera tillväxten, och P i synnerhet27, vilket kan manifestera sig som en dynamisk reglering av symbiontförekomst. Faktum är att bevis som samlats in från koraller över stora revvidder (>1 000 km) tyder på att värdar har kapacitet att begränsa symbionttillväxten genom reglering av P, även om detta varierar beroende på korallart27.
Sammantaget tyder dessa studier på en ökad värmetolerans med en åtföljande minskning av antingen produktionen eller translokationen av näringsämnen (dvs. benägenheten för symbios) på grund av miljöförändringar. Kraftfulla metoder för enstaka juveniler, såsom kvantifiering av syreanvändning via mikrorespirometri, bör därför användas för att förstå de grundläggande mekanismerna som rör metabolism och sedan tillämpas på bevarandefrågor som att förstå värmetolerans. Detta presenteras här som ett mikrorespirometriverktyg för fysiologiska mätningar, avsett att undersöka näringsförhållandet mellan korallyngel och deras algsymbionter, men lämpligt för andra små marina organismer.
Organismernas användning eller produktion av syre kan mätas genom att placera dem i individuella, hermetiskt tillslutna respirometrikammare eller "respirometrar" (nedan kallade "respirometrar"), där syreförändringen mäts med hjälp av optoder3. Optoder är sonder som mäter syrekoncentration med hjälp av ljuspulser, och loggningsmätningar över tid gör det möjligt att beräkna andnings- och/eller fotosynteshastigheter. I praktiken liknar mätning av andning mätning av fotosyntes hos koraller, förutom att korallerna inkuberas i totalt mörker. Subtrahering av korallens och symbionternas totala dagliga andning från den totala dagliga fotosyntesen resulterar i en syredifferential (syredelta)2,3. I allmänhet använder organismer mer syre än de producerar, vilket resulterar i ett underskott. Detta kan omvandlas till kolekvivalenter eftersom syre och kol förbrukas i ett fast förhållande2. Kolöverskottet kan användas av korallen för tillväxt, slemsyntes och reproduktion och andra viktiga metaboliska behov12.
Detta protokoll beskriver en mikrorespirationsmetod (figur 1) som användes för att mäta andningshastigheter (R) för enskilda korallyngel med hjälp av en specialtillverkad 1,5 ml glaskammardesign (injektionsflaska med GL25-gänga och 20 mm hög, med bump/ridge, plattslipad kant och skruvlock med hål; se materialtabell) fylld med 0,5 μm filtrerat havsvatten. Fiberoptiska optoder (se Materialförteckning) fördes in i varje kammare genom ett hål i sidan av locket. Varje enskild korall fästes ovanför en hårdmaskig plattform med genomströmningsomrörarplatta ovanför en magnetisk omrörningsstång för att säkerställa tillräcklig blandning av vatten i kammaren. I det representativa exemplet här mättes två kontroller eller "blanks" (kammare som var identiska förutom närvaron av provet) samtidigt med de tre replikatkamrarna, eftersom vi hade flera kontroller igång samtidigt. Installationsexemplet (figur 2) visar dock bara användningen av fyra kanaler; Detta kan ökas med hjälp av flera styrenheter och flera genomströmningsstativ. Temperaturen kan också styras i detta system genom att sänka ner varje kammare i ett skräddarsytt vattenbad med förinställda vattentemperaturer (27 °C för styrning eller 31 °C för högtemperaturspänningen i exempeldata här) med hjälp av ett system för återcirkulerande genomströmning (kontinuerligt, mjukt flöde inställt på 75 l/h). Omrörarplattans plattform och omrörarplattan med kugghjul kan vara av vilken storlek som helst och kan göras så stora eller så små som krävs för att rymma antalet glaskammare. I det här exemplet var plattformen och plattan cirka 34 cm x 26 cm x 3 cm (Materialtabell). Kalibrering av optoderna utfördes före varje körning med hjälp av två standardlösningar som representerar 0 % och 100 % syremättnad vid lämplig vattentemperatur och salthalt för denna experimentella miljö.
Protocol
1. Uppställning av utrustning och koraller i andningskamrarna
OBS: Reproduktivt färdiga koraller (dvs. de som hade rosapigmenterade ägg/spermiebuntar synliga från fragmenterade grenar från arten Acropora tenuis-kolonier ) lossnade från revet vid Magnetic Island (19° 6.249'S; 146° 51.728'E) på dagen för fullmåne i oktober 2018 (tillståndsnummer: G12/35236.1), samlades in och fördes till laboratoriet för koralllek, där unga koraller odlades och växte.
- På mätdagen, anslut de två vattenbadsplattorna med blått polyrör och kopplingar (se materialförteckning; Figur 1 [5], Figur 2A,B). Dessa kommer att fungera som inkubatorer efter anslutning med det blå polyröret till varmvattenberedaren/kylaren. Se till att motorplattan tydligt kan ses genom de genomskinliga vattenbadsplattorna när andningskamrarna inte är på plats.
- Anslut de två slangarna till varmvattenberedaren/kylaren (se materialförteckning). Slå på varmvattenberedaren/kylaren och ställ sedan in önskad experimenttemperatur (27 °C eller 31 °C).
- Anslut vattenbadets bas (steg 1.1) till basmotorplattan med de magnetiska kugghjulen (Figur 1 [6, 7] och Figur 3A) och anslut sedan denna enhet till en strömkälla (Figur 3B). Slå på strömkällan för att aktivera kugghjulen, vilket aktiverar omrörarstängerna i kamrarna.
- Modulera vattenflödet efter behov (t.ex. kontinuerligt, mjukt flöde inställt på 75 l/h med långsam omrörning vid 30 rpm) med hjälp av ventilanslutningsknapparna (Figur 3C).
- För att montera respirometrikammaren, lägg till den magnetiska pärlan (Figur 1 [1.5]) till glaskammaren (Figur 1 [1.6]), och sedan den ogenomskinliga plastgenomströmningsbasen (Figur 1 [1.4]) i glaskammaren (Figur 4A). Storleken på kammaren och den magnetiska pärlan beror på organismen och studiesystemet av intresse.
OBS: Det finns hål i plastbasen för att möjliggöra vattenflöde och cirkulation från rörelsen av magnetpärlan i botten. - Limma fast korallen med akvarielim (se materialtabell) på den svarta dragkedjan som är placerad i plastbasen (Figur 4B-D). För att göra detta limmar du först fast korallungen på en bit svart plast och limmar sedan fast den här biten på plastbasen. När korallen är ordentligt fastsatt (härdning av limmet är nästan omedelbart), skruva fast locket med O-ringen (Figur 4A) på glaskammaren. Utför dessa åtgärder under vattnet i en separat bassäng för att se till att ingen luft finns i andningskammaren.
OBS: Vattenvolymen i respirometern (dvs. effektiv volym = 1.5 ml) bestämdes genom fullständig nedsänkning av kammaren under vattnet. Antagandet är att, i förhållande till vattenvolymen, är förskjutningen från massan/densiteten hos den mycket lilla korallen försumbar. Mikrocentrifugröret på 1.5 ml visas här för skala (Figur 4A). - Placera kamrarna ordentligt i vattenbaden (Figur 5A). Se till att glaskamrarna är i kontakt med det temperaturkontrollerade vattnet för experimentet.
- Anslut de O2 fiberoptiska kablarna (se materialtabell) så att de är i kontakt med syresensorns punkter (hädanefter kallade fläckar; se materialtabell) genom att föra in dem i hålet som borrats i sidan av lockkamrarna. Dessa små fläckar är syrekänsliga och kommer att upptäcka och överföra signalen inifrån kammaren genom den fiberoptiska kabeln.
- Lägg till VVS-tejp (vit tunn självtätande tejp) för att få kabeln att sitta tätt och för att låta den sitta stadigt inne i vattenkammaren. Se till att den enskilda korallen kan ses (som visas i figur 5B), med bruna tentakler uppåt, inuti kammaren (figur 5B, video 1).
OBS: Kostnadsuppskattningar för komponenterna i apparaten finns i tabell 1.
- Lägg till VVS-tejp (vit tunn självtätande tejp) för att få kabeln att sitta tätt och för att låta den sitta stadigt inne i vattenkammaren. Se till att den enskilda korallen kan ses (som visas i figur 5B), med bruna tentakler uppåt, inuti kammaren (figur 5B, video 1).
2. Standardförfarande för mätning av andning med O2-systemet
- Öppna programvaran för syremätning (se materialförteckning).
- Mät temperaturen i rummet där kalibreringen ska utföras. Detta kommer att behövas senare för kalibreringssteget (steg 2.8).
- Montera de optiska sensorerna och locken. För att göra detta, anslut all fiberoptik till den matchande porten i O2 -modulen. Se till att matcha lock 1 med sensor 1, lock 2 med sensor 2 och så vidare.
- För att ställa in kamrarna för kalibrering, fukta först en bit ren svamp med lite vatten för omvänd osmos (RO) och sätt in den i varje kammare.
OBS: Svampen ska inte droppa, bara vara fuktig. Det kan droppa på den fiberoptiska platsen. Se till att platsen inte är våt innan du går vidare till nästa steg. - Placera kamrarna upp och ner med den matchande fiberoptiken (Figur 6). Detta gör det möjligt att skruva loss kammaren utan att vidröra fiberoptiken och tillsätta natriumsulfiten för 0%-kalibreringen.
- Kontrollera signalen för varje sensor innan kalibreringen påbörjas. Gå igenom alla flikar i programvarugränssnittet och kontrollera signalvärdet (övre vänstra hörnet) (Figur 7A), se till att de inte varierar nämnvärt. Kontrollera O2-manualen för acceptabla värden för experimentuppställningen (beroende på organism och förhållanden av intresse). För denna specifika inställning, vid en rumstemperatur på 25,3 °C, är en FTC (syresensor spot flow genom cellens normala intervall) på 20,59 med signalen vid 179,5 acceptabel.
- Öppna Program och kontrollera inställningarna i programvaran för att bekräfta att de är korrekta enligt beskrivningen nedan. Om popup-fönstret inte visas omedelbart efter att du har öppnat programmet kan du göra det genom att klicka på knappen Inställningar i det nedre vänstra hörnet av programvarugränssnittet.
- Kontrollera att den externa temperatursensorn är aktiverad (Figur 7B). Ändra inställningen till Fast temperatur (Figur 7C). Lägg sedan till rumstemperaturvärdet och klicka på kopiera inställning till alla andra kanaler.
- Ändra inställningen till Minska signaldrift (Minska signalavdriften ) (Figur 7C). Välj sedan Sensorinställningar och välj nivå 2. Annars, om du använder små volymer, kommer driften att vara så hög att den blir svår att kalibrera.
- Kontrollera de allmänna inställningarna för kanalerna. Tryck på Ok om det räcker. Klicka på kopiera inställningar till alla kanaler och klicka sedan på OK.
- Kalibrera sensorerna. För kanal 1-kalibrering, gå till fliken Kanal 1 och tryck på knappen Kalibrera . Välj 2-punkt i vatten eller fuktig luft.
- För "luft"-kalibreringen, doppa en bit skum i vatten, placera den inuti kammaren och vänta tills signalen stabiliseras (se bilderna före och efter luftkalibrering). När den är stabil, tryck på "ställ in luft". Klicka på luft > Kalibrera > inställd luft.
- Ställ in kalibreringen 0 % och 100 % (Figur 7D). Ta bort kammaren från locket och placera den i nästa lock så att luftkalibreringssignalen är klar när 0 %-kalibreringen i den första sensorn är klar. Använd en överföringspipett och fyll locket med 2 % natriumsulfit. Vänta tills signalen har stabiliserats.
OBS: Signalen tar vanligtvis längre tid att stabilisera jämfört med luftkalibreringen. Om ett varningsmeddelande visas som säger att "värdena ligger utanför det typiska intervallet", se till att natriumsulfiten är färsk. Upprepa samma kalibreringsprocess för alla kanaler. Bered natriumsulfiten genom att tillsätta 2 g i 100 ml RO-vatten. - När kalibreringen är klar, skölj andningskamrarna väl och torka kamrarna och locken. Se till att det inte finns något vatten i det fiberoptiska hålet.
- Placera organismen (enstaka korallyngel, i detta exempel) inuti andningskamrarna och stäng med lock. När du placerar locken, se till att göra det när kamrarna är helt nedsänkta och det absolut inte finns någon luft inuti.
- Placera kamrarna ordentligt i omrörarplattan och anslut fiberoptiken.
- Slå på strömförsörjningen. Se till att vattnet inuti kamrarna blandas helt. Ställ in temperaturen i kylaren/värmaren till de valda experimentella temperaturerna.
- Slå på pumpen och värmaren (steg 1.2 och 1.4).
- Tryck på log på O 2-mätprogramvarans gränssnitt för att starta inspelningen.
Representative Results
Databehandling och analys
Även om det finns många metoder för att bearbeta rådata från respirometriexperiment, rekommenderas det att använda R-paketet respR28. I linje med delningen av protokollen ovan, som förespråkar öppen vetenskap och reproducerbarhet, gör detta paket det möjligt att dela databehandling och analys i en lätt reproducerbar form och har utformats med detta i åtanke. Det är en kostnadsfri plattform med öppen källkod och avsökningssystemagnostisk och kan enkelt installeras antingen från CRAN eller GitHub. Fullständig kod och exempel för respR underhålls och finns på https://github.com/januarharianto/respR.
RespR-paketet har funktioner för att importera, visualisera och utföra kvalitetskontroll på respirometridata och för att beräkna andningsfrekvenser antingen automatiskt eller från manuellt valda regioner. Den kan också justera hastigheten för bakgrundsandning och omvandlingsfrekvenser till vanliga utdataenheter. Stegen för att bearbeta data från mikrorespirometrisystemet beskrivs nedan. I denna studie användes data från respirometrisystemet som ett exempel, men paketet accepterar också indata från majoriteten av kommersiellt tillgängliga syrgassondsystem samt generiska R-dataobjekt. Mer information om paketet, inklusive fullständig dokumentation och handledningar, finns på paketets webbplats på https://januarharianto.github.io/respR/index.html.
Importera rådata
Rådatafilen (.txt) importeras. respR känner igen formatet och tolkar det till en allmän R-dataram som kan användas i efterföljande funktioner. Det är dock viktigt att notera att detta är valfritt; dessa filer och praktiskt taget alla syretidsseriedata kan också importeras med hjälp av basfunktioner (anges nedan) av vem som helst med grundläggande kunskaper om R.
#load respR
Bibliotek(respR)
#Import ---
Data <- import_file("file.txt")
#Firesting-Pryo-fil identifierad
Inspektera och visualisera data
En viktig del av alla dataanalysuppgifter är att plotta och inspektera data för att leta efter uppenbara avvikelser eller mönster, eller till och med bara för att hjälpa till att förstå dem. Inspektionsfunktionen används här (figur 8A), som söker efter problem som är gemensamma för respirometridata, t.ex. icke-numeriska eller saknade värden.
#inspect en enda syrekolonn
Inspektera < (data, tid = 3, syre = 8, bredd = 0,2)
Denna funktion plottar också syretidsserien och beräknar en rullande hastighet (nedre panelen) för att hjälpa till att belysa hur denna hastighet kan förändras under experimentets gång. Dessa rullande hastighetsdiagram hjälper till att informera om vilka regioner i dessa hastighetskurvor som ska extraheras. När det gäller standard- eller rutinmetabolism är de önskade regionerna de där hastigheten visar stabilitet (t.ex. efter cirka 3 000; Figur 8B).
Här blir minskande syre detekterbart först efter rad 200 i den fullständiga tidsseriepanelen. Mönster som detta är mycket vanliga i respirometridata; Det finns ofta en längre period av instabilitet i början av ett experiment när systemet stabiliseras och provet acklimatiseras till de experimentella förhållandena. Vi rekommenderar att priser endast extraheras från tidsserien efter den här inledande instabiliteten, vilket också belyser vikten av visualiseringar.
Extrakt
respR har två funktioner för att extrahera andningshastigheter. Den första är funktionen calc_rate(), som gör att en hastighet kan extraheras manuellt genom att ange en region med tid, rad eller syrenivå. Detta är mycket vanligt vid respirometrianalyser och en helt acceptabel metod för att bestämma en frekvens så länge urvalskriterierna beslutas och tillämpas konsekvent28.
Ett mer robust och objektivt sätt är att använda funktionen auto_rate(), som identifierar linjära områden i data. Dessa regioner är de med konsekvent ihållande andningsfrekvens, tilldelade automatiskt med hjälp av maskininlärning. Denna funktion är också användbar för detektering av låga signaler (som i de prover som används i den aktuella studien, på grund av den låga biomassan i denna ålder). Denna funktion gör det möjligt att identifiera de mest linjära, lägsta och högsta hastigheterna med hjälp av oberoende, objektiva och statistiskt robusta metoder28. Exemplet här identifierar en linjär region som förekommer från cirka tidpunkterna 3 000 till 5 000. Det bör noteras att flera linjära regioner kan identifieras, men detta avsnitt är den högst rankade, eller mest linjära, regionen (figur 8C).
#Determine mest linjära (dvs. konsekventa) hastigheten
Skattesats <-auto_rate(INSP)
Justering av bakgrunden
Bakgrundsfrekvenser från kontrollexperiment kan bestämmas på ett liknande sätt som i exemplet ovan och kan användas för att justera provfrekvenserna med hjälp av funktionen adjust_rate() (Figur 9A; observera att den fullständiga analysen inte visas här, endast justeringen). Fullständiga exempel finns på respR :s webbplats.
#Adjust pris för bakgrund
rate_adj <-adjust_rate(rate, by = bg) #saved bg objekt
Tryck(rate_adj)
Omräkningskurser
Det sista steget är att konvertera hastigheterna till önskade utgångsenheter, med hjälp av de ursprungliga enheterna för rådata, respirometerns effektiva volym och andra experimentella data, inklusive normalisering till blindmätningar (figur 9B). Utdata kan vara en absolut andningshastighet, det vill säga av hela provet, eller en mass- eller ytområdesspecifik hastighet. Den ytområdesspecifika hastigheten var den output som användes här, vilket specifikt är den absoluta hastigheten dividerad med provets yta (figur 9C).
Som diskuterats ovan utvecklades detta system för att mäta mycket små prover. Därför förväntade vi oss låga värden och potentiell överlappning med blindmått. En viss nivå av signal förväntas inom blankstegen, och när de undersöks ligger dessa värden inom det förväntade intervallet för allmänt experimentellt brus, möjligen på grund av sonddrift, små temperaturförändringar eller bubblor på sonderna. På grund av den lilla provstorleken, och därför den lilla effektiva volymen som används, är användningen av ämnen särskilt viktig här, särskilt för varje körning. Representativa värden har tagits med här som ett exempel (figur 10). Med tanke på den lilla provstorleken rekommenderar vi att du använder ämnena vid varje körning för att standardisera mätningarna per körning.
Dessa blankvärden används sedan för att standardisera behandlingsmätningsvärden. Med tanke på att koraller andas förutom att producera syre kan ämnesomsättningen variera från negativa till positiva värden. Här ges ett exempel på representativa resultat för de andningsvärden som detekterats med hjälp av mikroandningsverktyget. Dessa resultat bestämdes från ett framgångsrikt experiment på enstaka korallyngel (figur 10). Sammantaget förväntades respiration vara svår att upptäcka i detta exempeldataset (avsiktligt), med tanke på provernas lilla storlek; Detta understryker värdet av denna metod för att fånga denna låga signaltröskel. Dessa representativa resultat visar andning i mörker vid de minsta provstorlekarna som testats, vilket understryker den lägsta detektionströskeln för detta system. Vi mätte också under två förhållanden (kontroll och hög temperaturstress). Efter att ha standardiserat till de blankprover som mättes per körning varierade värdena från nära noll (kontroll) till en median på ~-5e-5 för stressbehandlingen. Som väntat var andningen låg. Dessa resultat visar tydligt representativa värden för blankprov, samt en jämförelse mellan kontroll och hög temperatur för dessa mycket små prover.
Figur 1: Schematisk framställning av det nya mikrorespirometriverktyget för fysiologisk karakterisering av korallholobiont (koralldjur + symbionter) eller någon liten organism (<1 mm). Anpassade respirometrikammare tillverkades (nummer 1; 1.1-1.6). Dessa inkluderar lock (1.1) med syresensorpunkter (1.2), och den enskilda juvenilen (1.3) placeras på ett genomströmningsstativ (1.4) ovanpå en magnetomrörare (1.5), som alla passar in i glaskammaren (1.6). Styrenheten (2) är fäst på platsen med en fiberoptisk kabel som passar in i locket (1) och ansluts till datorn (3). Värmaren/kylaren (4) ansluts till respirometriplattan (5) med genomströmningsvattnet (indikeras med chevronpilar för riktning), som sitter ovanpå omrörarplattan (6) med växlar (7), som drivs av motorn (8) och strömförsörjningen (9). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Inställning av mikrorespirometri. Flera alternativ finns tillgängliga, inklusive (A) en andningsplatta eller (B) ansluten till flera plattor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Specialbyggd magnetisk omrörarplatta ovanpå respirometriplattan. Varje kammare har (A) ett magnetiskt omrörarväxel undertill, (B) som drivs av en motor, med (C) andningsplattan ansluten med slang till värmaren/kylaren. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Anpassad inställning av respirometrikammare. (A) Komponenter (från vänster till höger: lock, injektionsflaska av glas, stativ, 1,5 ml tub för våg och omrörare). (B) Individuellt genomströmningsstativ som provexemplaret sitter i. C) Genomströmningsstativet uppifrån och ned. (D) och med stativet placerat inuti injektionsflaskan av glas med locket fastskruvat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Injektionsflaskor av glas placerade i omrörarplattan. (A) Specialbyggd omrörarplatta med (B) en närbild av hela glasflaskan med lockinställningen. Den juvenila korallen kan ses genom locket här (brun prick), ovanpå dragkedjan, med fiberoptiken placerad i locköppningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Kamrarna placerade upp och ner, redo för kalibrering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Viktiga steg i programvaran för syremätning. (A) Kontrollera signalen för varje sensor. En optimal signal för denna studie och sensorer visas i syresensorns spot FTC (normalt område). (B) Kontrollera signaldriften. (C) Ställ in och kontrollera behandlingstemperaturerna. (D) Ställ in och kontrollera kalibreringarna 0 % och 100 %. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Utdatasteg för respR-analys I. (A) Inspektera kommandot och utdata. (B) Kontrollera hastighetsstabiliteten. (C) Bestäm den mest linjära hastigheten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Utgående steg II för respR-analys . (A) Justera hastigheten för bakgrund, (B) Konvertera och (C) kontrollera hastigheterna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Representativa resultat från mikrorespirometriverktyget. Medianrespiration (O2 ± standardfel) hos replikaten hos enskilda korallyngel, inklusive blankvärden samt andning hos individer under kontroll och stressförhållanden vid höga temperaturer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Vy uppifrån och ner av respirometrikammaren med den juvenila korallen inuti under en mätsession. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Tabell 1: Kostnadsberäkningar för komponenter i respirometriapparaten. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
Detta arbete beskriver konstruktionen av en skräddarsydd mikrorespirometri som kan användas för att kvantifiera mängden syre som konsumeras och produceras av små fastsittande vattenlevande organismer. De kritiska komponenterna i detta protokoll inkluderar installationen av kamrarna, inklusive fläckarna, och kalibreringen av den låga signalen med hjälp av respR-paketet , där en låg signal kan definieras som hastigheter som kännetecknas av grunda eller bullriga sluttningar. Customkammaren och dess konfiguration gör det möjligt att upptäcka även låga signaler, medan användningen av R-paketet hjälper till att skydda mot problem där förekomsten av grunda eller bullriga sluttningar kan leda till feltolkning av resultat (t.ex. falskt positiva).
Potentiella modifieringar som kommer att behövas för andra användare inkluderar säkring av organismen av intresse i den skräddarsydda kammaren. I det här fallet användes ett litet, styvt buntband och akvarielim för att fästa den enda ungen på plastbasen, som sedan limmades fast på slipsen. Det bör noteras att korallyngel för detta experiment placerades på svart plastfolie. Denna plast gjorde det enkelt att ta bort korallynglen, som effektivt gled av plasten för att inte fysiskt skada dem under borttagningen. Korallungar fäster på substratet de sätter sig på, så det rekommenderas att sätta dem på liknande plastmaterial med hjälp av en konstgjord peptid16 för att underlätta deras avlägsnande för limningsprocessen. För att ytterligare minimera hanteringsstress och påverkan på andningsresponsen rekommenderas det att låta korallerna monterade på dragkedjor acklimatisera sig i 1-2 veckor, vilket är vanligt i många stressexperiment för vuxna koraller. Andra modifieringar kan behövas för att säkra organismen ovanför punkten i locket och för att möjliggöra vattencirkulation. Ett annat viktigt felsökningssteg involverar signaldetektering, särskilt i lutningen av syrgastidsserien där hastigheter bör bestämmas. I slutändan handlar detta om en kombination av att använda gott omdöme för att utesluta uppenbart instabila data, och funktionerna inom respR för att tillåta att frekvenser extraheras från antingen konsekvent valda regioner eller automatiskt genom att identifiera linjära regioner av data. Fler exempel på hur du gör detta finns på respR :s webbplats.
Denna metod utvecklades för att utvidga mätningarna av den nedre gränsen för andning till extremt små, fastsittande marina ryggradslösa djur. Den uppenbara begränsningen är att detta protokoll kan vara mer benäget att få falskt positiva resultat jämfört med protokoll som är utformade för större biomassa. Men med tanke på att detta var poängen med designen - att mäta dessa nedre gränser - har detta tagits med i designen, och proceduren kan användas med respR-paketet för att bättre skydda mot falskt positiva resultat. Det är också viktigt att vara medveten om att det finns andra system för att mäta respiration30 och mätning av små organismer, inklusive respirometri på enskilda hoppkräftor31 i mindre volymer än detta (~0,5-1 ml), men att de antingen är dyra eller saknar specifika komponenter (omrörningsförmåga). Detta system är dock öppen källkod och har relativt låg kostnad jämfört med kommersiella system (t.ex. Core Microplate-system). Detta system innehåller också viktiga metodologiska överväganden som omrörning, vilket andra system kan sakna. Den interna omrörarfunktionen är viktig för att efterlikna den naturliga vattenblandningen hos många marina organismer (t.ex. hoppkräftor genom att simma), vilket ofta inte är möjligt och kan göra data i stort sett oanvändbara. Andra blandningsmetoder som finns tillgängliga innebär däremot att man placerar hela respirometern på en gigantisk vippbänk, vilket kräver ytterligare utrustning och har begränsad framgång vid blandning, eller blandning via vibrationer, vilket kan orsaka störningar för organismen. Av denna anledning är detta det enda systemet som kan utföra respirometri på unga koraller eller andra mycket små fastsittande organismer. Som referens kan nämnas att storleksintervallet för de prover som ingår här varierade från 2,1 till 3,6 polyper (motsvarande endast några månader gamla), med en minsta till maximal medelarea på 1,3 till 4,5mm2.
Respirometri är ett grundläggande mått i ekologiska studier, och det finns många metoder för detta ändamål. De flesta av dessa befintliga metoder är dock inriktade på prover med hög biomassa, inklusive hel fisk, korallfragment eller sjögräs 32,33,34. Denna metod är den första som använder enskilda korallyngel. Dessutom finns det många potentiella tillämpningar för denna metod, eftersom den ger viktig fysiologisk information om organismens funktion. Detta kan vara viktigt för studier som syftar till att karakterisera grundläggande hälsouppskattningar35, förstå rollen av akut eller långvarig stress under korallontogeni såsom värmestress36, eller för att tillhandahålla trösklar som förvaltare kan fastställa för att hjälpa till att skydda och förbättra korallrevens hälsa37. Med tanke på att korallen är en holobiont och symbiontsamhället är relativt flexibelt i detta skede och under hela det första levnadsåret38, skulle det vara intressant att para ihop respirometridata med förändringar i samhällen över tid, för att fullt ut kontextualisera organismens funktion som helhet. Det är viktigt att denna metod bidrar till "öppen vetenskap"-tekniker som hjälper till att ge en översikt för att skapa anpassade experimentella uppställningar som kan delas, förbättras och standardiseras öppet.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Sam Noonan för hans hjälp och råd, Sven Uthicke för användningen av de första respirometrikamrarna, Ben Shelab för hans tekniska illustration och Australian Institute of Marine Science-verkstaden för skräddarsydd bearbetning av respirometrikammaradaptrar och hållare. Korallerna samlades in under följande Great Barrier Reef Marine Park-tillstånd till AIMS G12 / 35236.1. Koraller kräver inga etiska tillstånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cost | |||
| (1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
| 1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
| 1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
| 1.3 individual organism | NA | NA | NA |
| 1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
| 1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
| 1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
| 2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
| 3 computer | NA | NA | NA |
| 4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
| 5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
| 6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
| 8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
| 9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
| Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
| Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
| Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
| Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |
References
- Quigley, K. M. A fast, precise, in-vivo method for micron-level 3D models of corals using dental scanners. Methods in Ecology and Evolution. 13 (10), 2159-2166 (2022).
- Svendsen, M. B. S., Bushnell, P. G., Steffensen, J. F. Design and setup of intermittent-flow respirometry system for aquatic organisms. Journal of Fish Biology. 88 (1), 26-50 (2016).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates: a Manual for Scientists. , Oxford University Press. (2018).
- Carey, N., Harianto, J., Byrne, M. Sea urchins in a high-CO2 world: partitioned effects of body size, ocean warming and acidification on metabolic rate. The Journal of Experimental Biology. 219 (Pt 8), 1178-1186 (2016).
- Clark, T. D., Sandblom, E., Jutfelt, F. Aerobic scope measurements of fishes in an era of climate change: respirometry, relevance and recommendations. The Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 15), 2771-2782 (2013).
- Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
- Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world's coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
- Morris, L. A., Voolstra, C. R., Quigley, K. M., Bourne, D. G., Bay, L. K. Nutrient availability and metabolism affect the stability of coral-symbiodiniaceae symbioses. Trends in Microbiology. 27 (8), 678-689 (2019).
- Yellowlees, D., Rees, T. A. V., Leggat, W. Metabolic interactions between algal symbionts and invertebrate hosts. Plant, Cell & Environment. 31 (5), 679-694 (2008).
- Rädecker, N., et al. Using Aiptasia as a model to study metabolic interactions in cnidarian-Symbiodinium symbioses. Frontiers in Physiology. 9, 214 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Davy, S. K., Allemand, D., Weis, V. M.
- Weis, V. M. Cellular mechanisms of Cnidarian bleaching: stress causes the collapse of symbiosis. The Journal of Experimental Biology. 211 (Pt 19), 3059-3066 (2008).
- Baker, D. M., Freeman, C. J., Wong, J. C. Y., Fogel, M. L., Knowlton, N. Climate change promotes parasitism in a coral symbiosis. The ISME Journal. 12 (3), 921-930 (2018).
- Chakravarti, L. J., van Oppen, M. J. H. Experimental evolution in coral photosymbionts as a tool to increase thermal tolerance. Frontiers in Marine Science. 5, 227 (2018).
- Quigley, K. M., Alvarez Roa, C., Beltran, V. H., Leggat, B., Willis, B. L. Experimental evolution of the coral algal endosymbiont, Cladocopium goreaui: lessons learnt across a decade of stress experiments to enhance coral heat tolerance. Restoration Ecology. 29 (3), e13342 (2021).
- Buerger, P., et al. Heat-evolved microalgal symbionts increase coral bleaching tolerance. Science Advances. 6 (20), eaba2498 (2020).
- Bieri, T., Onishi, M., Xiang, T., Grossman, A. R., Pringle, J. R. Relative contributions of various cellular mechanisms to loss of algae during cnidarian bleaching. PLoS One. 11 (4), e0152693 (2016).
- Tremblay, P., Gori, A., Maguer, J. F., Hoogenboom, M., Ferrier-Pagès, C. Heterotrophy promotes the re-establishment of photosynthate translocation in a symbiotic coral after heat stress. Scientific Reports. 6, 38112 (2016).
- Tremblay, P., Grover, R., Maguer, J. F., Hoogenboom, M., Ferrier-Pagès, C. Carbon translocation from symbiont to host depends on irradiance and food availability in the tropical coral Stylophora pistillata. Coral Reefs. 33 (1), 1-13 (2014).
- Wooldridge, S. A. Is the coral-algae symbiosis really 'mutually beneficial' for the partners. Bioessays. 32 (7), 615-625 (2010).
- Wooldridge, S. A. Breakdown of the coral-algae symbiosis: towards formalising a linkage between warm-water bleaching thresholds and the growth rate of the intracellular zooxanthellae. Biogeosciences. 10 (3), 1647-1658 (2013).
- Coles, S. L., Jokiel, P. L. Effects of temperature on photosynthesis and respiration in hermatypic corals. Marine Biology. 43, 209-216 (1977).
- Marubini, F., Davies, P. S. Nitrate increases zooxanthellae population density and reduces skeletogenesis in corals. Marine Biology. 127, 319-328 (1996).
- Iglesias-Prieto, R., Matta, J. L., Robins, W. A., Trench, R. K. Photosynthetic response to elevated temperature in the symbiotic dinoflagellate Symbiodinium microadriaticum in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10302-10305 (1992).
- Karako-Lampert, S., Katcoff, D. J., Achituv, Y., Dubinsky, Z., Stambler, N. Responses of Symbiodinium microadriaticum clade B to different environmental conditions. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 318 (1), 11-20 (2005).
- Blanckaert, A. C. A., Reef, R., Pandolfi, J. M., Lovelock, C. E. Variation in the elemental stoichiometry of the coral-zooxanthellae symbiosis. Coral Reefs. 39, 1071-1079 (2020).
- Harianto, J., Carey, N., Byrne, M. respR-An R package for the manipulation and analysis of respirometry data. Methods in Ecology and Evolution. 10 (6), 912-920 (2019).
- Gamble, S., Carton, A. G., Pirozzi, I. Open-top static respirometry is a reliable method to determine the routine metabolic rate of barramundi. Lates calcarifer. Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 47 (1), 19-28 (2014).
- Burford, B. P., et al. Rapid range expansion of a marine ectotherm reveals the demographic and ecological consequences of short-term variability in seawater temperature and dissolved oxygen. The American Naturalist. 199 (4), 523-550 (2022).
- Morozov, S., McCairns, R. J. S., Merilä, J. FishResp: R package and GUI application for analysis of aquatic respirometry data. Conservation Physiology. 7 (1), coz003 (2019).
- Leclercq, N., Gattuso, J. -P., Jaubert, J. Primary production, respiration, and calcification of a coral reef mesocosm under increased CO2 partial pressure. Limnology and Oceanography. 47 (2), 558-564 (2002).
- Anthony, K. R. N., Hoegh-Guldberg, O. Variation in coral photosynthesis, respiration and growth characteristics in contrasting light microhabitats: an analogue to plants in forest gaps and understoreys. Functional Ecology. 17, 246-259 (2003).
- Moulin, L., et al. Long-term mesocosms study of the effects of ocean acidification on growth and physiology of the sea urchin Echinometra mathaei. Marine Environmental Research. 103, 103-114 (2015).
- Quigley, K. M., Bay, L. K., van Oppen, M. J. H. Genome-wide SNP analysis reveals an increase in adaptive genetic variation through selective breeding of coral. Molecular Ecology. 29 (12), 2176-2188 (2020).
- Brunner, C. A., Ricardo, G. F., Uthicke, S., Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Effects of climate change and light limitation on coral recruits. Marine Ecology Progress Series. 690, 65-82 (2022).
- Quigley, K. M., Alvarez Roa, C., Torda, G., Bourne, D., Willis, B. L. Co-dynamics of Symbiodiniaceae and bacterial populations during the first year of symbiosis with Acropora tenuis juveniles. MicrobiologyOpen. 9 (2), e959 (2020).
- Quigley, K. M., Bay, L. K., Torda, G., Willis, B. L. Leveraging new knowledge of Symbiodinium community regulation in corals for conservation and reef restoration. Marine Ecology Progress Series, 600. , 245-253 (2018).
