Isolierung und Kultivierung von vestibulären und spiralförmigen Ganglien-Somata von neonatalen Nagetieren für Patch-Clamp-Aufnahmen
Summary
Hier werden Methoden vorgestellt, die detaillierte Anweisungen zum Sezieren, Dissoziieren, Kultivieren und Patch-Clamp-Aufzeichnen von vestibulären Ganglion- und Spiralganglienneuronen des Innenohrs liefern.
Abstract
Die kompakte Morphologie der isolierten und kultivierten Innenohrganglienneuronen ermöglicht eine detaillierte Charakterisierung der Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren, die zur Zellvielfalt in dieser Population beitragen. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die für eine erfolgreiche Sezierung, Dissoziation und Kurzzeitkultivierung der Somata von bipolaren Neuronen des Innenohrs zum Zwecke der Patch-Clamp-Aufnahme erforderlich sind. Detaillierte Anweisungen zur Präparation von vestibulären Ganglienneuronen werden mit den notwendigen Modifikationen bereitgestellt, die für die Beschichtung von Spiralganglienneuronen erforderlich sind. Das Protokoll enthält Anweisungen für die Durchführung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen in der perforierten Patch-Konfiguration. Beispielhafte Ergebnisse, die die Spannungsklemmenaufzeichnungen von hyperpolarisationsaktivierten zyklischen Nukleotid-gesteuerten (HCN)-vermittelten Strömen charakterisieren, unterstreichen die Stabilität der perforierten Patch-Aufzeichnungskonfiguration im Vergleich zur Standardkonfiguration mit gerissenen Patches. Die Kombination dieser Methoden, isolierte Somata und perforierte Patch-Clamp-Ableitungen, kann verwendet werden, um zelluläre Prozesse zu untersuchen, die lange, stabile Aufzeichnungen und die Erhaltung des intrazellulären Milieus erfordern, wie z. B. die Signalübertragung durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren.
Introduction
Die bipolaren Neuronen des Nervus vestibulocochlearis verbinden die sensorischen Haarzellen des Innenohrs mit dem Hirnstamm. Sie sind Hauptträger von Informationen über Schall und Kopfbewegungen; Eine Schädigung dieser wichtigen Zellen führt zu Taubheit und Gleichgewichtsstörungen. Die vestibulären und auditiven Anteile des Nervs bestehen jeweils aus unterschiedlichen Zelltypen, die morphologisch und funktionell vielfältig sind 1,2. Im vestibulären System feuern zwei afferente Subpopulationen spontan in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen2. Es wird angenommen, dass das afferente Spike-Timing eine zugrundeliegende Diversität in der Zusammensetzung der Ionenkanäle widerspiegelt 3,4. Im auditorischen System gibt es zwei Hauptsubpopulationen von Spiralganglienneuronen (SGNs); Während Typ-I-SGNs mit einzelnen Innenhaarzellen5 in Kontakt treten, kontaktieren Typ-II-SGNs mehrere Außenhaarzellen5. In-vitro-Ableitungen von semi-intakten und organotypischen Kulturen deuten auf Unterschiede in den Membraneigenschaften von Typ I und Typ II SGNs hin 6,7.
Viele Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren, die sich an den Enden dieser Neuronen befinden, befinden sich auch in ihren Zellkörpern. So können Kulturen des isolierten vestibulären und des Spiralganglion-Somata in vitro untersucht werden, um zu verstehen, wie Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren zur Reaktion dieser Neuronen beitragen. Die kompakte Morphologie der isolierten Zellkörper ermöglicht qualitativ hochwertige elektrische Ableitungen, die sich für eine detaillierte Charakterisierung von spannungsabhängigen Ionenkanälen und Neurotransmitterrezeptoren eignen. Der einfache Zugang zu einer repräsentativen Vielfalt von Neuronen-Subtypen ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse der Zelldiversität.
In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von dissoziierten Ganglienzellkörpern aus dem oberen Teil des vestibulären Ganglions bei Ratten am postnatalen Tag (P)9 bis P20 vorgestellt. Es werden auch Vorschläge für die Erweiterung dieser Methoden auf das Spiralganglion gegeben, zusätzlich zu den Schritten, die für die erfolgreiche Extraktion, Dissoziation und Plattierung der Ganglienzellen erforderlich sind. Diese Methoden sind eine Weiterentwicklung derjenigen, die in Veröffentlichungen verschiedener Laboratorien entwickelt wurden 8,9,10. Dieses Dokument enthält auch eine Anleitung zur Auswahl gesunder Zellen für Patch-Clamp-Aufnahmen.
Schließlich umreißt das Protokoll das Verfahren für die Patch-Clamp-Aufzeichnung unter Verwendung der perforierten Patch-Konfiguration11. Obwohl die Konfiguration mit perforiertem Pflaster zeitaufwändiger und technisch anspruchsvoller ist als die gebräuchlichere Konfiguration mit gerissenem Pflaster, ist sie besser für die Aufrechterhaltung des zytoplasmatischen Milieus, das lange und stabile Aufnahmesitzungen ermöglicht. Die Vorteile dieser Aufzeichnungskonfiguration werden hier durch die verbesserte Stabilität von Hyperpolarisations-aktivierten kationischen Strömen in perforierten Patches im Vergleich zu ruptured-Patch-Aufnahmen veranschaulicht.
Dieses Protokoll ist in fünf Abschnitte unterteilt. In den Abschnitten 1-3 werden Lösungen und Werkzeuge beschrieben, die im Voraus vorbereitet und gespeichert werden können. Abschnitt 4 beschreibt die Schritte zur Dissektion und Beschichtung der vestibulären und SGNs. Abschnitt 5 beschreibt die Schritte zur Aufzeichnung von den Neuronen nach einer Periode in Kultur. In unseren Händen werden Abschnitt 4 und Abschnitt 5 über einen Zeitraum von 2 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellten Methoden sind spezifisch für Aufzeichnungen von isolierten Neuronen; Frühere Studien konzentrierten sich auf Ableitungen von Axonendigungen in einem semi-intakten Präparat. Im Vergleich zu bestehenden Klemmenaufzeichnungstechniken bieten isolierte Aufzeichnungen ein überlegenes Raumklemmen- und Isopotentialverhalten. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll Zugang zu einer breiteren Stichprobe von Neuronen, da nur kelchtragende Subpopulationen in semi-intakten Aufzeichnungen der vestibulären Ep…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Jing Bing Xue und Dr. Ruth Anne Eatock für ihre frühen Beiträge zu diesen Methoden. Diese Arbeit wurde von NIH NIDCD R03 DC012652 und NIH NIDCD DC012653S sowie R01 DC0155512 zu RK und T32 DC009975 zu DB, NN und KR unterstützt.
Materials
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
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