Aislamiento y cultivo de somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp
Summary
A continuación se presentan métodos que proporcionan instrucciones detalladas para la disección, la disociación, el cultivo y el registro de pinzas de parche de las neuronas ganglionares vestibulares y ganglionares espirales del oído interno.
Abstract
La morfología compacta de las neuronas ganglionares del oído interno aisladas y cultivadas permite caracterizaciones detalladas de los canales iónicos y los receptores de neurotransmisores que contribuyen a la diversidad celular en esta población. Este protocolo describe los pasos necesarios para la disección, disociación y cultivo a corto plazo exitosos de la somata de las neuronas bipolares del oído interno con el fin de realizar registros de pinzas de parche. Se proporcionan instrucciones detalladas para preparar las neuronas ganglionares vestibulares con las modificaciones necesarias para colocar placas en las neuronas ganglionares espirales. El protocolo incluye instrucciones para realizar registros de patch-clamp de celda completa en la configuración de patch perforado. Los resultados de ejemplo que caracterizan los registros de pinza de voltaje de corrientes mediadas por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización (HCN) resaltan la estabilidad de la configuración de registro de parches perforados en comparación con la configuración de parches rotos más estándar. La combinación de estos métodos, somata aislado más registros de pinza de parche perforado, se puede utilizar para estudiar procesos celulares que requieren registros largos y estables y la preservación del medio intracelular, como la señalización a través de receptores acoplados a proteínas G.
Introduction
Las neuronas bipolares del nervio vestibulococlear conectan las células ciliadas sensoriales del oído interno con el tronco encefálico. Son los principales portadores de información sobre el sonido y los movimientos de la cabeza; El daño a estas células importantes conduce a la sordera y a los trastornos del equilibrio. Las porciones vestibular y auditiva del nervio están compuestas por distintos tipos de células que son morfológica y funcionalmente diversas 1,2. En el sistema vestibular, dos subpoblaciones aferentes disparan espontáneamente a intervalos regulares o irregulares2. Se cree que la sincronización de picos aferentes refleja una diversidad subyacente en la composición de los canales iónicos 3,4. En el sistema auditivo, hay dos subpoblaciones principales de neuronas ganglionares espirales (SGN); mientras que las SGN de tipo I entran en contacto con células ciliadas internas individuales5, las SGN de tipo II contactan con múltiples células ciliadas externas5. Los registros in vitro de cultivos semiintactos y organotípicos sugieren diferencias en las propiedades de membrana de las SGN de tipo I y tipo II 6,7.
Muchos canales iónicos y receptores de neurotransmisores que se encuentran en las terminales de estas neuronas también se encuentran en sus cuerpos celulares. Como tal, los cultivos del soma vestibular aislado y del ganglio espiral se pueden estudiar in vitro para comprender cómo los canales iónicos y los receptores de neurotransmisores contribuyen a la respuesta de estas neuronas. La morfología compacta de los cuerpos celulares aislados permite registros eléctricos de alta calidad, adecuados para la caracterización detallada de canales iónicos dependientes de voltaje y receptores de neurotransmisores. El fácil acceso a una variedad representativa de subtipos de neuronas permite un análisis de alto rendimiento de la diversidad celular.
Este artículo presenta un método para aislar y cultivar cuerpos de células ganglionares disociadas de la porción superior del ganglio vestibular en ratas en el día postnatal (P)9 a P20. También se proporcionan sugerencias para extender estos métodos al ganglio espiral, además de los pasos necesarios para extraer, disociar y colocar placas con éxito en las células ganglionares. Estos métodos son una evolución de los ideados en publicaciones de diversos laboratorios 8,9,10. También se incluye en este documento una guía para seleccionar células sanas para los registros de patch-clamp.
Por último, el protocolo describe el procedimiento para el registro de patch-clamp utilizando la configuración de patch-patch-perforado11. Aunque la configuración de parche perforado requiere más tiempo y es más desafiante técnicamente que la configuración de parche roto más común, es mejor para mantener el entorno citoplasmático que permite sesiones de grabación largas y estables. Los beneficios de esta configuración de grabación se ilustran aquí a través de la estabilidad mejorada de las corrientes catiónicas activadas por hiperpolarización en parches perforados en relación con los registros de parches rotos.
Este protocolo está organizado en cinco secciones. En las secciones 1 a 3 se describen las soluciones y herramientas que se pueden preparar y almacenar con antelación. En la sección 4 se describen los pasos para la disección y la siembra de las células vestibulares y las SGN, y en la sección 5 se describen los pasos para el registro de las neuronas después de un período de cultivo. En nuestras manos, la sección 4 y la sección 5 se realizan durante un período de 2 días consecutivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos presentados aquí son específicos para grabaciones de neuronas aisladas; Estudios anteriores se han centrado en grabaciones de terminales axónicos en una preparación semiintacta. En comparación con las técnicas de grabación de terminales existentes, las grabaciones aisladas ofrecen un comportamiento superior de fijación de espacio e isopotencial. Además, este protocolo proporciona acceso a una muestra más amplia de neuronas, ya que solo las subpoblaciones portadoras de cáliz son accesibles en los r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los doctores Jing Bing Xue y Ruth Anne Eatock por sus primeras contribuciones a estos métodos. Este trabajo fue apoyado por NIH NIDCD R03 DC012652 y NIDH NIDCD DC012653S, y R01 DC0155512 a RK y T32 DC009975 a DB, NN y KR.
Materials
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
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