Summary

Patch-Clamp Kayıtları için Yenidoğan Kemirgenlerinden Vestibüler ve Spiral Ganglion Somata'nın İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

Burada, iç kulağın vestibüler ganglion ve spiral ganglion nöronlarından diseksiyon, ayrıştırma, kültürleme ve yama-klemp kaydı için ayrıntılı talimatlar sağlayan yöntemler sunulmaktadır.

Abstract

İzole edilmiş ve kültürlenmiş iç kulak ganglion nöronlarının kompakt morfolojisi, bu popülasyondaki hücre çeşitliliğine katkıda bulunan iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin ayrıntılı karakterizasyonlarına izin verir. Bu protokol, yama-kelepçe kayıtları amacıyla iç kulak bipolar nöronlarının somalarının başarılı bir şekilde diseksiyonu, ayrıştırılması ve kısa süreli kültürlenmesi için gerekli adımları özetlemektedir. Vestibüler ganglion nöronlarının hazırlanması için ayrıntılı talimatlar, spiral ganglion nöronlarının kaplanması için gerekli modifikasyonlarla birlikte sağlanır. Protokol, delikli yama konfigürasyonunda tüm hücre yama kelepçesi kayıtlarını gerçekleştirmek için talimatlar içerir. Hiperpolarizasyonla aktive olan siklik nükleotid kapılı (HCN) aracılı akımların voltaj-kelepçe kayıtlarını karakterize eden örnek sonuçlar, daha standart yırtılmış yama konfigürasyonuna kıyasla delikli yama kayıt konfigürasyonunun kararlılığını vurgulamaktadır. Bu yöntemlerin kombinasyonu, izole somata artı delikli-yama-kelepçe kayıtları, uzun, kararlı kayıtlar ve G-proteinine bağlı reseptörler aracılığıyla sinyalleme gibi hücre içi ortamın korunmasını gerektiren hücresel süreçleri incelemek için kullanılabilir.

Introduction

Vestibülokoklear sinirin bipolar nöronları, iç kulağın duyusal tüy hücrelerini beyin sapına bağlar. Ses ve kafa hareketleri hakkında temel bilgi taşıyıcılarıdır; Bu önemli hücrelerin zarar görmesi sağırlık ve denge bozukluklarına yol açar. Sinirin vestibüler ve işitsel kısımlarının her biri, morfolojik ve fonksiyonel olarak farklı hücre tiplerinden oluşur 1,2. Vestibüler sistemde, iki afferent alt popülasyon, düzenli veya düzensiz aralıklarla kendiliğinden ateşlenir2. Afferent spike zamanlamasının, iyon kanalı bileşimi 3,4’teki altta yatan bir çeşitliliği yansıttığı düşünülmektedir. İşitsel sistemde, spiral ganglion nöronlarının (SGN’ler) iki ana alt popülasyonu vardır; Tip I SGN’ler tek tek iç saç hücrelerine5 temas ederken, Tip II SGN’ler birden fazla dış saç hücresinetemas eder 5. Yarı bozulmamış ve organotipik kültürlerden elde edilen in vitro kayıtlar, Tip I ve Tip II SGN’lerin membran özelliklerinde farklılıklar olduğunu göstermektedir 6,7.

Bu nöronların terminallerinde bulunan birçok iyon kanalı ve nörotransmitter reseptörü de hücre gövdelerinde bulunur. Bu nedenle, izole vestibüler ve spiral ganglion somata kültürleri, iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin bu nöronların tepkisine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için in vitro olarak incelenebilir. İzole edilmiş hücre gövdelerinin kompakt morfolojisi, voltaj kapılı iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin ayrıntılı karakterizasyonu için uygun olan yüksek kaliteli elektriksel kayıtlara izin verir. Temsili çeşitlilikteki nöron alt tiplerine kolay erişim, hücre çeşitliliğinin yüksek verimli analizine olanak tanır.

Bu makale, sıçanlarda postnatal günde (P)9 ila P20’de vestibüler ganglionun üst kısmından ayrışmış ganglion hücre gövdelerini izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem sunmaktadır. Ganglion hücrelerinin başarılı bir şekilde çıkarılması, ayrıştırılması ve kaplanması için gerekli adımlara ek olarak, bu yöntemlerin spiral gangliona genişletilmesi için öneriler de sunulmaktadır. Bu yöntemler, çeşitli laboratuvarlardan 8,9,10 yayınlarda tasarlananların bir evrimidir. Bu yazıda ayrıca, yama kelepçesi kayıtları için sağlıklı hücrelerin seçilmesine yönelik rehberlik de yer almaktadır.

Son olarak, protokol, delikli yama yapılandırmasını kullanarak yama kelepçesi kaydı prosedürünü ana hatlarıyla belirtir11. Delikli yama konfigürasyonu, daha yaygın yırtılmış yama konfigürasyonundan daha fazla zaman alıcı ve teknik olarak daha zorlayıcı olsa da, uzun ve kararlı kayıt oturumlarına izin veren sitoplazmik ortamı korumak için daha iyidir. Bu kayıt konfigürasyonunun faydaları, yırtılmış yama kayıtlarına göre delikli yamadaki hiperpolarizasyonla aktive edilen katyonik akımların geliştirilmiş stabilitesi ile burada gösterilmektedir.

Bu protokol beş bölüm halinde düzenlenmiştir. Bölüm 1-3, önceden hazırlanabilecek ve depolanabilecek çözümleri ve araçları açıklar. Bölüm 4, vestibüler ve SGN’lerin diseke edilmesi ve kaplanması için adımları açıklar. Bölüm 5, kültürde bir süre sonra nöronlardan kayıt adımlarını açıklar. Bizim elimizde, bölüm 4 ve bölüm 5 art arda 2 günlük bir süre boyunca gerçekleştirilir.

Protocol

Burada açıklanan tüm hayvan kullanımları, Güney Kaliforniya Üniversitesi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokoldeki hayvanlar, Charles River Laboratuvarları’ndan elde edilen her iki cinsiyetten P3 ila P25 yaşlı Long Evans sıçanlarıdır, ancak bu yöntemler diğer kemirgen suşlarına da uygulanabilir. Tüm prosedürler sırasında bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmeli, ayrıca çözelti yapılırken sıçramaya karşı koruyucu gözlük tak?…

Representative Results

Voltaj adımları ailelerini uygulayarak voltaj-kelepçe protokollerini çalıştırmak, çeşitli farklı akım ailelerinin voltaja bağlı aktivasyonunu ortaya çıkarır. Bir VGN’den uyarılan ve yayınlanmış kayıtlardan13 uyarlanan tüm hücre akımlarının temsili örnekleri Şekil 1A,B’de gösterilmektedir. Depolarize edici voltajların uygulanması (Şekil 1B), çok hızlı bir şekilde etkinleşen ve etkisiz h…

Discussion

Burada sunulan yöntemler, izole nöronlardan alınan kayıtlara özgüdür; Önceki çalışmalar, yarı bozulmamış bir preparatta akson terminallerinden alınan kayıtlara odaklanmıştır. Mevcut terminal kayıt teknikleriyle karşılaştırıldığında, izole kayıtlar üstün boşluk kelepçesi ve izo-potansiyel davranışı sunar. Ek olarak, bu protokol daha geniş bir nöron örneğine erişim sağlar, çünkü vestibüler epitelin yarı bozulmamış kayıtlarında yalnızca kaliks taşıyan alt popülasyonlara…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Jing Bing Xue ve Ruth Anne Eatock’a bu yöntemlere erken katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NIDCD R03 DC012652 ve NIH NIDCD DC012653S tarafından desteklenmiştir ve R01 RK’ya ve T32’ye DC009975 DB, NN ve KR’ye DC0155512.

Materials

Amphotericin Sigma-Aldrich A4888-100MG For perforated patch recordings.
ATP di-sodium Sigma-Aldrich A7699 Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044 additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge USA Scientific 2641-0016
Bunsen burner
CaCl2 J.T. Baker 1311-01 Additive to internal solution
Collagenase Sigma-Aldrich C5318 one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40  Warner Instruments 64-0707
DMSO Biotium 90082
Dnase I,from bovine pancreas Sigma-Aldrich 11284932001 one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt) Fine Science Tools 11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11255-20
EGTA Sigma-Aldrich E0396 Additive to internal solution
Electrode Puller Narashige PC-10
Epi-illumination light source  Zeiss  CL 1500 ECO
Ethanol Decon Labs 2716 for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes Sutter Instruments BF140-117-10
Fine-edged dissection blade Fine Science Tools 10010-00
Glass Pasteur Pipettes VWR 14673-010 to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16140063 additive to culture medium
HEPES Sigma-Aldrich H3375-100G for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers  VWR 76549-914
Insulated bucket filled with ice to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate Sigma Aldrich P9458-250G Additive to internal solution
KCl Sigma-Aldrich P93333 Additive to internal solution
KOH (1 M) Honeywell 319376-500ML To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors Fine Science Tools 14133-13
Leibovitz medium  Sigma Aldrich L4386 dissection and bath solutions 
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes Warner Instruments 64-0236
luer-lok syringes, 30 ml BD 302832 for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement Fisher Scientific 41-090-101 base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate Sigma-Aldrich M1028 Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge  World Precision Instruments MF34G
Microforge Narashige MF-90 For electrode polishing.
N2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502-048 additiive to culture medium, for SGN
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Additive to internal solution
NaOH (1 M) Thomas Scientific 319511-500ML for titration pH
Osmometer Advanced Instruments Inc. 3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing USC Material Management MEDOX200 (Identifier: 00015) for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm Bemis PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml) Fisher Scientific 03-448-25 bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)  MWI Animal Health 15199 for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer  Nalgene 566-0020 for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm  CELLTREAT 229747 for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm Genessee Scientific 32-103 for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm Midland Scientific P7455 for gross dissection
pH Meter Mettler Toledo Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish Mattek P35GC-0-10-C to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes Warner Instruments 64-0375
Reference Cell World Precision Instruments RC1T
Scalpel blade Miltex 4-315
Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
Scientific Scale Mettler Toledo XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) Warner Instruments 64-0378
Small Animal Guillotine Kent Scientific DCAP
Small animal guillotine Kent Scientific DCAP for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope  Zeiss Stemi 2000
Straight surgical scissors Fine Science Tools 14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin Sigma Aldrich T1426 one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe  Covidien 8881500105 for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex VWR 945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) Millipore-Sigma CDUFBI001

References

  1. Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
  2. Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
  3. Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
  4. Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
  5. Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
  6. Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
  7. Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
  8. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  9. Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
  10. Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
  11. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
  12. Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
  13. Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
  14. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
  15. Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
  16. Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
  17. Izhikevich, E. M. . Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).
  18. Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
  19. Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
  20. Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
  21. Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
  22. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
  23. Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
  24. Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
  25. Eatock, R. A., Christov, F. . Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).
  26. Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
  27. Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
  28. Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
  29. Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
  30. Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
  31. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
  32. Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
  33. Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
  34. Liu, X. -. P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).

Play Video

Cite This Article
Iyer, M. R., Ventura, C., Bronson, D., Nowak, N., Regalado, K., Kalluri, R. Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (194), e64908, doi:10.3791/64908 (2023).

View Video