パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養
Summary
ここでは、内耳の前庭神経節および螺旋神経節ニューロンからの解剖、解離、培養、およびパッチクランプ記録の詳細な手順を提供する方法を示します。
Abstract
単離および培養された内耳神経節ニューロンのコンパクトな形態により、この集団全体の細胞の多様性に寄与するイオンチャネルと神経伝達物質受容体の詳細な特性評価が可能になります。このプロトコルはパッチクランプ記録の為に内耳の両極ニューロンの体細胞の巧妙な解剖、解離および短期培養に必要なステップを概説する。前庭神経節ニューロンを調製するための詳細な指示は、らせん神経節ニューロンをプレーティングするために必要な修正とともに提供される。このプロトコルには、穴あきパッチ構成で全セルパッチクランプ記録を実行するための手順が含まれています。過分極活性化環状ヌクレオチド(HCN)媒介電流の電圧クランプ記録を特徴付ける結果の例は、より標準的な破裂パッチ構成と比較して、穴あきパッチ記録構成の安定性を強調しています。単離体細胞と穿孔パッチクランプ記録というこれらの方法の組み合わせは、Gタンパク質共役受容体を介したシグナル伝達など、長く安定した記録や細胞内環境の保存を必要とする細胞プロセスの研究に使用できます。
Introduction
前庭蝸牛神経の双極ニューロンは、内耳の感覚有毛細胞を脳幹に接続します。それらは、音と頭の動きに関する情報の主要な担い手です。これらの重要な細胞の損傷は、難聴や平衡障害につながります。神経の前庭部分と聴覚部分は、それぞれ形態学的および機能的に多様な異なる細胞タイプで構成されています1,2。前庭系では、2つの求心性亜集団が規則的または不規則な間隔で自発的に発火する2。求心性スパイクのタイミングは、イオンチャネル組成の根本的な多様性を反映していると考えられている3,4。聴覚系には、らせん神経節ニューロン(SGN)の2つの主要な亜集団があります。一方、I型SGNは個々の内有毛細胞に接触し5、II型SGNは複数の外有毛細胞5に接触する。セミインタクト培養および器官型培養からのin vitro記録は、I型SGNとII型SGNの膜特性の違いを示唆しています6,7。
これらのニューロンの末端に見られる多くのイオンチャネルと神経伝達物質受容体は、それらの細胞体にも見られます。そのため、単離された前庭およびらせん神経節体細胞の培養を in vitro で研究して、イオンチャネルと神経伝達物質受容体がこれらのニューロンの応答にどのように寄与するかを理解することができます。単離された細胞体のコンパクトな形態により、電位依存性イオンチャネルや神経伝達物質受容体の詳細な特性評価に適した高品質の電気記録が可能になります。代表的なニューロンサブタイプに簡単にアクセスできるため、細胞多様性のハイスループット解析が可能です。
本稿では、ラットの出生後(P)9〜P20に、前庭神経節の上層部から解離した神経節細胞体を単離して培養する方法を紹介します。また、神経節細胞の抽出、解離、およびプレーティングを成功させるために必要なステップに加えて、これらの方法をらせん状神経節に拡張するための提案も提供されています。これらの方法は、さまざまな研究所の出版物で考案された方法の進化形です8,9,10。また、この論文には、パッチクランプ記録用の健康な細胞を選択するためのガイダンスも含まれています。
最後に、プロトコルは、穿孔パッチ構成11を使用したパッチクランプ記録の手順を概説する。穿孔パッチ構成は、より一般的な破裂パッチ構成よりも時間がかかり、技術的にも困難ですが、細胞質環境を維持するのに優れているため、長時間安定した記録セッションが可能です。この記録構成の利点は、破裂パッチ記録と比較して、穴あきパッチの過分極活性化カチオン電流の安定性が向上することで示されています。
このプロトコルは 5 つのセクションに分かれています。セクション 1 から 3 では、事前に準備して保存できるソリューションとツールについて説明します。セクション4では、前庭およびSGNを解剖およびプレーティングするステップについて説明し、セクション5では、培養期間後のニューロンから記録するステップを説明します。私たちの手では、セクション4とセクション5は2日間連続して実行されます。
Protocol
ここに記載されているすべての動物の使用は、南カリフォルニア大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されています。このプロトコルの動物は、チャールズリバー研究所から入手した雌雄のP3〜P25年齢のロングエバンスラットですが、これらの方法は他のげっ歯類株にも適用できます。すべての手順では白衣と手袋を着用し、溶液を作るときは飛沫防止ゴーグルを着用する必要?…
Representative Results
電圧ステップのファミリを印加して電圧クランププロトコルを実行すると、さまざまな電流ファミリの電圧依存的なアクティブ化が明らかになります。VGNから誘発され、公開された記録13から適応された全セル電流の代表例を図1A、Bに示す。脱分極電圧(図1B)を印加すると、非常に急速に活性化および不活性化する内?…
Discussion
ここで紹介する方法は、単離されたニューロンからの記録に固有のものです。これまでの研究では、半無傷の調製物における軸索終末からの記録に焦点が当てられてきた。既存の端子記録技術と比較すると、絶縁記録は優れたスペースクランプと等電位挙動を提供します。さらに、このプロトコルは、萼軸受の亜集団のみが前庭上皮の半無傷の記録でアクセス可能であるため、ニューロンの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jing Bing Xue博士とRuth Anne Eatock博士には、これらの方法への初期の貢献に感謝します。この研究は、NIH NIDCD R03 DC012652とNIH NIDCD DC012653S、R01 DC0155512 から RK に、T32 DC009975 から DB、NN、および KR の支援を受けました。
Materials
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
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Cite This Article
Iyer, M. R., Ventura, C., Bronson, D., Nowak, N., Regalado, K., Kalluri, R. Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (194), e64908, doi:10.3791/64908 (2023).