בידוד וטיפוח סומאטה גנגליון ווסטיבולרי וספירלי ממכרסמים יילודים להקלטות טלאי
Summary
מוצגות כאן שיטות המספקות הוראות מפורטות לניתוח, ניתוק, תרבית ורישום מהדק טלאי מגנגליון שיווי המשקל ונוירוני גנגליון ספירלי באוזן הפנימית.
Abstract
המורפולוגיה הקומפקטית של נוירוני גנגליון באוזן הפנימית מבודדים ומתורבתים מאפשרת אפיון מפורט של תעלות היונים וקולטני המוליכים העצביים התורמים למגוון התאים באוכלוסייה זו. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הדרושים לניתוח מוצלח, ניתוק, וטיפוח לטווח קצר של הסומטה של נוירונים דו-קוטביים באוזן הפנימית לצורך רישומי מהדק טלאי. הוראות מפורטות להכנת נוירונים גנגליון שיווי משקל מסופקים עם השינויים הדרושים עבור ציפוי נוירונים גנגליון ספירלי. הפרוטוקול כולל הוראות לביצוע הקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים בתצורת התיקון המחורר. תוצאות לדוגמה המאפיינות את רישומי מהדק המתח של זרמים בתיווך נוקלאוטידים מחזוריים המופעלים על ידי היפרפולריזציה (HCN) מדגישות את היציבות של תצורת רישום טלאי מחורר בהשוואה לתצורת התיקון הקרוע הסטנדרטית יותר. השילוב של שיטות אלה, סומאטה מבודדת בתוספת רישומי מהדק טלאי מחורר, יכול לשמש לחקר תהליכים תאיים הדורשים הקלטות ארוכות ויציבות ושימור הסביבה התוך-תאית, כגון איתות באמצעות קולטנים מצומדים לחלבון G.
Introduction
הנוירונים הדו-קוטביים של עצב שיווי המשקל מחברים את תאי השערה הסנסוריים של האוזן הפנימית לגזע המוח. הם נשאים עיקריים של מידע על תנועות קול וראש; פגיעה בתאים חשובים אלה מובילה לחירשות ולהפרעות שיווי משקל. החלקים הווסטיבולריים והשמיעתיים של העצב מורכבים כל אחד מסוגי תאים נפרדים שהם מגוונים מורפולוגית ותפקודית 1,2. במערכת שיווי המשקל, שתי תת-אוכלוסיות afferent יורות באופן ספונטני במרווחי זמן קבועים או לא סדירים2. תזמון ספייק אפרנטי נחשב כמשקף גיוון בסיסי בהרכב תעלות היונים 3,4. במערכת השמיעה ישנן שתי תת-אוכלוסיות עיקריות של נוירוני גנגליון ספירליים (SGNs); בעוד SGNs מסוג I יוצרים מגע עם תאי שיער פנימיים בודדים5, SGNs מסוג II יוצרים מגע עם תאי שיער חיצוניים מרובים5. הקלטות במבחנה מתרבויות שלמות למחצה ואורגנוטיפיות מצביעות על הבדלים בתכונות הממברנה של סוג I וסוג II SGNs 6,7.
תעלות יונים וקולטנים רבים של מוליכים עצביים הנמצאים במסופים של תאי עצב אלה נמצאים גם בגופם התא. לכן, תרביות של שיווי המשקל המבודד והגנגליון הספירלי סומאטה יכולות להיחקר במבחנה כדי להבין כיצד תעלות יונים וקולטני מוליכים עצביים תורמים לתגובה של נוירונים אלה. המורפולוגיה הקומפקטית של גופי התא המבודדים מאפשרת הקלטות חשמליות באיכות גבוהה, המתאימה לאפיון מפורט של תעלות יונים מגודרות מתח וקולטנים של מוליכים עצביים. גישה נוחה למגוון מייצג של תת-סוגים של תאי עצב מאפשרת ניתוח בתפוקה גבוהה של מגוון התאים.
מאמר זה מציג שיטה לבידוד וטיפוח גופי תאי גנגליון מנותקים מהחלק העליון של גנגליון שיווי המשקל בחולדות ביום שלאחר הלידה (P)9 עד P20. כמו כן ניתנות הצעות להרחבת שיטות אלה לגנגליון הספירלי, בנוסף לשלבים הנדרשים לחילוץ, ניתוק וציפוי מוצלחים של תאי הגנגליון. שיטות אלה הן אבולוציה של אלה שהומצאו בפרסומים ממעבדות שונות 8,9,10. כמו כן כלולה במאמר זה הדרכה לבחירת תאים בריאים להקלטות מהדק טלאי.
לבסוף, הפרוטוקול מתאר את ההליך להקלטת מהדק טלאי באמצעות תצורת תיקוןמחורר 11. למרות שתצורת התיקון המחורר גוזלת זמן רב יותר ומאתגרת יותר מבחינה טכנית מאשר תצורת התיקון הקרוע הנפוצה יותר, היא טובה יותר לשמירה על הסביבה הציטופלזמית המאפשרת הקלטות ארוכות ויציבות. היתרונות של תצורת הקלטה זו מודגמים כאן באמצעות היציבות המשופרת של זרמים קטיוניים המופעלים על ידי היפרפולריזציה בטלאי מחורר ביחס להקלטות טלאי קרוע.
פרוטוקול זה מאורגן בחמישה חלקים. סעיפים 1-3 מתארים פתרונות וכלים שניתן להכין ולאחסן מבעוד מועד. סעיף 4 מתאר את השלבים לניתוח וציפוי שיווי המשקל וה-SGNs. סעיף 5 מתאר את השלבים להקלטה מהנוירונים לאחר תקופה בתרבית. בידינו, סעיף 4 וסעיף 5 מבוצעים על פני תקופה של יומיים רצופים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המוצגות כאן הן ספציפיות להקלטות מתאי עצב מבודדים; מחקרים קודמים התמקדו בהקלטות ממסופי אקסון בהכנה שלמה למחצה. בהשוואה לטכניקות הקלטה טרמינליות קיימות, הקלטות מבודדות מציעות התנהגות מעולה של מהדק חלל ופוטנציאל איזו. בנוסף, פרוטוקול זה מספק גישה למדגם רחב יותר של נוירונים, שכן רק תת-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר ג’ינג בינג שו וד”ר רות אן אטוק על תרומתן המוקדמת לשיטות אלה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NIDCD R03 DC012652 ו- NIH NIDCD DC012653S, ו- R01 DC0155512 ל- RK ו- T32 DC009975 ל- DB, NN ו- KR.
Materials
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
- Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
- Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
- Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
- Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
- Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
- Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
- Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
- Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
- Izhikevich, E. M. . Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
- Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
- Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
- Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
- Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
- Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
- Eatock, R. A., Christov, F. . Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).
- Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
- Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
- Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
- Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
- Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
- Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
- Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
- Liu, X. -. P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).
