Isolering og dyrking av vestibulære og spiralganglion somata fra nyfødte gnagere for patch-klemmeopptak
Summary
Presentert her er metoder som gir detaljerte instruksjoner for dissekering, dissosiering, dyrking og patch-klemmeopptak fra vestibulære ganglion og spiral ganglionneuroner i det indre øret.
Abstract
Den kompakte morfologien til isolerte og dyrkede indre øreganglionnevroner muliggjør detaljerte karakteriseringer av ionkanaler og nevrotransmitterreseptorer som bidrar til cellediversitet over denne populasjonen. Denne protokollen skisserer trinnene som er nødvendige for vellykket dissekering, dissosiering og kortsiktig dyrking av somata av bipolare nevroner i det indre øret med henblikk på patch-klemmeopptak. Detaljerte instruksjoner for fremstilling av vestibulære ganglionneuroner er utstyrt med de nødvendige modifikasjonene som trengs for plating av spiralganglionneuroner. Protokollen inneholder instruksjoner for å utføre fullcelle patch-clamp-opptak i den perforerte patch-konfigurasjonen. Eksempelresultater som karakteriserer spenningsklemmeopptakene av hyperpolarisasjonsaktiverte sykliske nukleotid-gated (HCN)-medierte strømmer, fremhever stabiliteten til perforert-patch-opptakskonfigurasjonen i forhold til den mer standard ruptured-patch-konfigurasjonen. Kombinasjonen av disse metodene, isolerte somata pluss perforerte-patch-klemmeopptak, kan brukes til å studere cellulære prosesser som krever lange, stabile opptak og bevaring av intracellulært miljø, for eksempel signalering gjennom G-proteinkoblede reseptorer.
Introduction
De bipolare nevronene i den vestibulokokleære nerven forbinder de sensoriske hårcellene i det indre øret til hjernestammen. De er hovedbærere av informasjon om lyd og hodebevegelser; Skader på disse viktige cellene fører til døvhet og balanseforstyrrelser. De vestibulære og auditive delene av nerven består hver av forskjellige celletyper som er morfologisk og funksjonelt forskjellige 1,2. I det vestibulære systemet skyter to afferente subpopulasjoner spontant med intervaller som enten er regelmessige eller uregelmessige2. Afferente piggtiming antas å reflektere et underliggende mangfold i ionkanalsammensetning 3,4. I hørselssystemet er det to hovedpopulasjoner av spiralganglionneuroner (SGN); mens type I SGN-er kontakter individuelle indre hårceller5, type II SGN-er kontakter flere ytre hårceller5. In vitro-opptak fra semi-intakte og organotypiske kulturer antyder forskjeller i membranegenskapene til Type I og Type II SGN 6,7.
Mange ionkanaler og nevrotransmitterreseptorer som finnes ved terminalene til disse nevronene, finnes også i deres cellelegemer. Som sådan kan kulturer av den isolerte vestibulære og spiralganglion somata studeres in vitro for å forstå hvordan ionkanaler og nevrotransmitterreseptorer bidrar til responsen til disse nevronene. Den kompakte morfologien til de isolerte cellelegemene muliggjør elektriske opptak av høy kvalitet, egnet for detaljert karakterisering av spenningsstyrte ionkanaler og nevrotransmitterreseptorer. Enkel tilgang til et representativt utvalg av nevronsubtyper muliggjør analyse av cellediversitet med høy gjennomstrømning.
Denne artikkelen presenterer en metode for å isolere og dyrke dissosierte ganglioncellelegemer fra den øvre delen av vestibulært ganglion hos rotter på barseldagen (P)9 til P20. Forslag er også gitt for å utvide disse metodene til spiralganglion, i tillegg til trinnene som kreves for vellykket ekstrahering, dissociering og plating av ganglioncellene. Disse metodene er en videreutvikling av de som er utviklet i publikasjoner fra ulike laboratorier 8,9,10. Også inkludert i dette papiret er veiledning for valg av friske celler for patch-klemmeopptak.
Til slutt skisserer protokollen prosedyren for patch-clamp-opptak ved hjelp av perforert-patch-konfigurasjonen11. Selv om den perforerte patch-konfigurasjonen er mer tidkrevende og mer teknisk utfordrende enn den mer vanlige ruptured-patch-konfigurasjonen, er den bedre for å opprettholde det cytoplasmatiske miljøet som muliggjør lange og stabile opptaksøkter. Fordelene med denne opptakskonfigurasjonen illustreres her gjennom den forbedrede stabiliteten til hyperpolarisasjonsaktiverte kationiske strømmer i perforert i forhold til ruptured-patch-opptak.
Denne protokollen er organisert i fem seksjoner. § 1-3 beskriver løsninger og verktøy som kan klargjøres og lagres på forhånd. Avsnitt 4 beskriver trinnene for dissekering og plating av vestibulære og SGN. Avsnitt 5 beskriver trinnene for opptak fra nevronene etter en periode i kultur. I våre hender utføres del 4 og seksjon 5 over en periode på 2 sammenhengende dager.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene som presenteres her er spesifikke for opptak fra isolerte nevroner; Tidligere studier har fokusert på opptak fra aksonterminaler i et semi-intakt preparat. Sammenlignet med eksisterende terminalopptaksteknikker, tilbyr isolerte opptak overlegen romklemme og iso-potensiell oppførsel. I tillegg gir denne protokollen tilgang til et bredere utvalg av nevroner, siden bare kalyxbærende underpopulasjoner er tilgjengelige i semi-intakte opptak av vestibulært epitel. Til slutt tillater isolerte opptak bruk av perfore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner Dr. Jing Bing Xue og Ruth Anne Eatock for deres tidlige bidrag til disse metodene. Dette arbeidet ble støttet av NIH NIDCD R03 DC012652 og NIH NIDCD DC012653S, og R01 DC0155512 til RK og T32 DC009975 til DB, NN og KR.
Materials
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
- Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
- Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
- Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
- Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
- Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
- Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
- Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
- Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
- Izhikevich, E. M. . Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
- Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
- Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
- Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
- Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
- Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
- Eatock, R. A., Christov, F. . Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).
- Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
- Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
- Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
- Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
- Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
- Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
- Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
- Liu, X. -. P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).
