Här presenteras metoder som ger detaljerade instruktioner för dissekering, dissociering, odling och patch-clamp-inspelning från vestibulära ganglion- och spiralganglieneuroner i innerörat.
Den kompakta morfologin hos isolerade och odlade ganglieneuroner i innerörat möjliggör detaljerade karakteriseringar av jonkanalerna och neurotransmittorreceptorerna som bidrar till celldiversiteten i denna population. Detta protokoll beskriver de steg som krävs för framgångsrik dissekering, dissociering och kortvarig odling av somata i innerörats bipolära neuroner i syfte att patch-clamp inspelningar. Detaljerade instruktioner för beredning av vestibulära ganglieneuroner är försedda med de nödvändiga modifieringar som behövs för plätering av spiralganglieneuroner. Protokollet innehåller instruktioner för att utföra patch-clamp-inspelningar i hela cellen i konfigurationen med perforerad patch. Exempelresultat som karakteriserar spänningskläminspelningar av hyperpolarisationsaktiverade cykliska nukleotidstyrda (HCN)-medierade strömmar belyser stabiliteten hos inspelningskonfigurationen för perforerade fläckar i jämförelse med den mer vanliga konfigurationen med spruckna fläckar. Kombinationen av dessa metoder, isolerade somata plus perforerade-patch-clamp-inspelningar, kan användas för att studera cellulära processer som kräver långa, stabila registreringar och bevarande av intracellulära miljöer, såsom signalering genom G-proteinkopplade receptorer.
De bipolära nervcellerna i den vestibulokokleära nerven förbinder de sensoriska hårcellerna i innerörat med hjärnstammen. De är de främsta förmedlarna av information om ljud och huvudrörelser; Skador på dessa viktiga celler leder till dövhet och balansstörningar. De vestibulära och auditiva delarna av nerven består var och en av distinkta celltyper som är morfologiskt och funktionellt olika 1,2. I det vestibulära systemet avfyras två afferenta subpopulationer spontant med intervaller som antingen är regelbundna eller oregelbundna2. Afferent spiktiming tros återspegla en underliggande mångfald i jonkanalssammansättningen 3,4. I hörselsystemet finns det två huvudsakliga subpopulationer av spiralganglieneuroner (SGN); medan SGN av typ I kontaktar enskilda inre hårceller5, kontaktar SGN av typ II flera yttre hårceller5. In vitro-registreringar från semi-intakta och organotypiska kulturer tyder på skillnader i membranegenskaperna hos SGN av typ I och typ II 6,7.
Många jonkanaler och neurotransmittorreceptorer som finns vid terminalerna av dessa neuroner finns också i deras cellkroppar. Som sådan kan kulturer av den isolerade vestibulära och spiralganglion somata studeras in vitro för att förstå hur jonkanaler och neurotransmittorreceptorer bidrar till svaret hos dessa neuroner. Den kompakta morfologin hos de isolerade cellkropparna möjliggör högkvalitativa elektriska inspelningar, lämpliga för detaljerad karakterisering av spänningsstyrda jonkanaler och neurotransmittorreceptorer. Enkel åtkomst till en representativ variation av neuronsubtyper möjliggör analys av celldiversitet med hög genomströmning.
Denna artikel presenterar en metod för att isolera och odla dissocierade gangliecellkroppar från den övre delen av det vestibulära gangliet hos råttor vid postnatal dag (P)9 till P20. Förslag ges också för att utvidga dessa metoder till spiralgangliet, utöver de steg som krävs för att framgångsrikt extrahera, dissociera och plätera gangliecellerna. Dessa metoder är en utveckling av de som utvecklats i publikationer från olika laboratorier 8,9,10. I detta dokument ingår också vägledning för att välja friska celler för patch-clamp-inspelningar.
Slutligen beskriver protokollet proceduren för patch-clamp-inspelning med hjälp av konfigurationen för perforerad patch11. Även om konfigurationen med perforerade plåster är mer tidskrävande och mer tekniskt utmanande än den vanligare konfigurationen med spruckna plåster, är den bättre för att upprätthålla den cytoplasmatiska miljön som möjliggör långa och stabila inspelningssessioner. Fördelarna med denna inspelningskonfiguration illustreras här genom den förbättrade stabiliteten hos hyperpolarisationsaktiverade katjonströmmar i perforerad patch i förhållande till spruckna patchinspelningar.
Detta protokoll är indelat i fem avsnitt. Avsnitt 1-3 beskriver lösningar och verktyg som kan förberedas och lagras i förväg. Avsnitt 4 beskriver stegen för dissekering och plätering av vestibulära och SGN:er. Avsnitt 5 beskriver stegen för registrering från neuronerna efter en period i odling. I våra händer utförs sektion 4 och sektion 5 under en period av 2 på varandra följande dagar.
Metoderna som presenteras här är specifika för inspelningar från isolerade neuroner; Tidigare studier har fokuserat på inspelningar från Axon-terminaler i en semi-intakt preparation. Jämfört med befintliga terminalinspelningstekniker erbjuder isolerade inspelningar överlägset rymdkläm- och isopotentialbeteende. Dessutom ger detta protokoll tillgång till ett bredare urval av neuroner, eftersom endast foderbärande subpopulationer är tillgängliga i semi-intakta registreringar av de vestibulära epitelerna. Sl…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Jing Bing Xue och Ruth Anne Eatock för deras tidiga bidrag till dessa metoder. Detta arbete stöddes av NIH NIDCD R03 DC012652 och NIH NIDCD DC012653S, och R01 DC0155512 till RK och T32 DC009975 till DB, NN och KR.
Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
Bunsen burner | |||
CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
DMSO | Biotium | 90082 | |
Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
Parafilm | Bemis | PM992 | |
Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
Vortex | VWR | 945300 | |
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |