تقييم مستويات الالتهام الذاتي في نموذجين مختلفين لخلايا البنكرياس باستخدام التألق المناعي LC3
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد مستويات الالتهام الذاتي في سرطان البنكرياس وخلايا أسينار البنكرياس من خلال التألق المناعي LC3 والقياس الكمي لنقطة LC3.
Abstract
الالتهام الذاتي هو عملية تقويضية متخصصة تؤدي إلى تحلل المكونات السيتوبلازمية بشكل انتقائي ، بما في ذلك البروتينات والعضيات التالفة. يسمح الالتهام الذاتي للخلايا بالاستجابة الفسيولوجية لمحفزات الإجهاد ، وبالتالي الحفاظ على التوازن الخلوي. قد تعدل الخلايا السرطانية مستويات الالتهام الذاتي للتكيف مع الظروف المعاكسة مثل نقص الأكسجة أو نقص المغذيات أو التلف الناجم عن العلاج الكيميائي. يعد سرطان البنكرياس الغدي القنوي أحد أكثر أنواع السرطان فتكا. تتمتع خلايا سرطان البنكرياس بنشاط التهام الذاتي العالي بسبب التنظيم النسخي والتنشيط بعد الترجمة لبروتينات الالتهام الذاتي.
هنا ، تم استخدام خط خلايا PANC-1 كنموذج لخلايا سرطان البنكرياس البشرية ، وتم استخدام خط خلايا البنكرياس acinar AR42J كنموذج فسيولوجي لخلايا الثدييات شديدة التمايز. استخدمت هذه الدراسة التألق المناعي لسلسلة ضوء البروتين المرتبطة بالأنابيب الدقيقة 3 (LC3) كمؤشر لحالة تنشيط الالتهام الذاتي. LC3 هو بروتين الالتهام الذاتي الذي يظهر ، في الظروف القاعدية ، نمطا منتشرا للتوزيع في السيتوبلازم (المعروف باسم LC3-I في هذه الحالة). يؤدي تحريض الالتهام الذاتي إلى اقتران LC3 بالفوسفاتيديل إيثانولامين على سطح البلعمة الذاتية المشكلة حديثا لتشكيل LC3-II ، وهو بروتين مرتبط بالغشاء يساعد في تكوين وتوسيع البلعمة الذاتية. لتحديد عدد هياكل الالتهام الذاتي الموسومة ، تم استخدام برنامج FIJI مفتوح المصدر بمساعدة أداة “3D Objects Counter”.
يسمح لنا قياس مستويات الالتهام الذاتي في كل من الظروف الفسيولوجية والخلايا السرطانية بدراسة تعديل الالتهام الذاتي في ظل ظروف متنوعة مثل نقص الأكسجة أو العلاج الكيميائي أو ضربة قاضية لبعض البروتينات.
Introduction
الالتهام الذاتي الكبير (يشار إليه عادة باسم الالتهام الذاتي) هو عملية تقويضية متخصصة تؤدي إلى تحلل المكونات السيتوبلازمية بشكل انتقائي ، بما في ذلك البروتينات والعضيات التالفة 1,2. يسمح الالتهام الذاتي للخلايا بالاستجابة الفسيولوجية لمحفزات الإجهاد ، وبالتالي الحفاظ على التوازن الخلوي3. أثناء الالتهام الذاتي ، يتم تشكيل حويصلة غشاء مزدوج: البلعمة الذاتية. يحتوي البلعمة الذاتية على جزيئات الشحن ويدفعها إلى الليزوزوم للتحلل 1,4.
تم تزيين البلعمة الذاتية بواسطة سلسلة ضوء البروتين المرتبطة بالبروتين الذاتي 3 (LC3) 5. عندما لا يتم تحفيز الالتهام الذاتي ، ينتشر LC3 في السيتوبلازم والنواة في شكل LC3-I. من ناحية أخرى ، عندما يتم تحفيز الالتهام الذاتي ، يتم اقتران LC3 مع فوسفاتيديل إيثانولامين في غشاء هياكل الالتهام الذاتي6. يعرف هذا التشكيل الجديد LC3 باسم LC3-II1. يتسبب تحول التشكل LC3 في حدوث تغييرات في توطينه الخلوي وهجرة دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد جل الكهربائي (SDS-PAGE) ، والتي يمكن اكتشافها بواسطة تقنيات مثل التألق المناعي واللطخة الغربية 5,7. بهذه الطريقة ، يعد اقتران LC3 حدثا رئيسيا في عملية الالتهام الذاتي التي يمكن استخدامها لقياس نشاط الالتهام الذاتي.
الخلية العنيبية البنكرياسية هي خلية شديدة التمايز ، في ظل ظروف صحية ، لديها معدل منخفض من الالتهام الذاتي. ومع ذلك ، في ظروف فسيولوجية مختلفة أو تحت التحفيز الدوائي ، يمكنهم تنشيط الالتهام الذاتي. لذلك ، فإن تحديد مستويات الالتهام الذاتي في خط الخلية هذا مفيد لدراسة الآثار المباشرة أو غير المباشرة المحتملة للعوامل الدوائية أو البيولوجية المختلفة على الالتهام الذاتي 8,9.
يعد سرطان البنكرياس الغدي القنوي أحد أكثر أنواع السرطان فتكا ، نظرا لتشخيصه المتأخر ومقاومته العالية للعلاج الكيميائي10. تتمتع خلايا سرطان البنكرياس بنشاط الالتهام الذاتي العالي بسبب التنظيم النسخي والتنشيط اللاحق للبروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي11. قد تقوم خلايا سرطان البنكرياس بتعديل مستويات الالتهام الذاتي استجابة للظروف غير المواتية مثل نقص الأكسجة أو الحرمان من المغذيات أو التلف الناجم عن العلاج الكيميائي11. وبالتالي ، فإن تحليل مستويات الالتهام الذاتي في خلايا سرطان البنكرياس يمكن أن يساعد في فهم كيفية تكيفها مع البيئات المختلفة وتقييم فعالية علاجات تعديل الالتهام الذاتي.
تظهر هذه الدراسة طريقة لأداء التألق المناعي LC3 في نموذجين خلويين متميزين للبنكرياس. النموذج الأول ، خلايا PANC-1 ، بمثابة نموذج لسرطان الغدة القنوية البنكرياس. تم علاج هذه الخلايا باستخدام gemcitabine ، وهو عامل علاج كيميائي ثبت سابقا أنه يحفز الالتهام الذاتي ، وتحديدا في خلايا سرطان البنكرياس التي تحمل جين فيروس ساركوما الفئران كيرستن (KRAS) 12,13. النموذج الثاني ، خلايا AR42J ، كان بمثابة نموذج فسيولوجي أكثر لخلايا البنكرياس الخارجية الإفراز. تم تمييز هذه الخلايا مع ديكساميثازون لتصبح أكثر تشابها مع خلايا البنكرياس الأسينار14. في هذه الخلايا ، تم تحفيز الالتهام الذاتي دوائيا من خلال استخدام PP242 ، وهو مثبط قوي ل mTOR15. في هذه الدراسة ، نوضح قابلية تطبيق البروتوكول الموصوف بنموذجين مختلفين للبنكرياس وقدرته على التمييز بين حالات الالتهام الذاتي المنخفض والعالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول بتصور توزيع LC3 الداخلي في الخلية وتحديد مستويات الالتهام الذاتي في ظل ظروف مختلفة. طريقة أخرى مماثلة تستخدم لتحليل توزيع LC3 وتحديد تنشيط الالتهام الذاتي تتضمن نقل LC3 المسمى بالتألق (مثل RFP-LC3) 19. يتميز نقل RFP-LC3 بمزايا عدم الحاجة إلى التثبيت …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من جامعة بوينس آيرس (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA) ، والمجلس الوطني للبحث العلمي والتكنولوجيا (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO ؛ و PUE 22920170100033) والوكالة الوطنية للترويج العلمي والتكنولوجي (PICT 2019-01664).
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. Digesting the expanding mechanisms of autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. LC3 and autophagy. Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. Pancreatic cancer. Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. Chapter 9 – Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and measuring autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
