Оценка уровней аутофагии в двух разных моделях клеток поджелудочной железы с использованием иммунофлуоресценции LC3
Summary
Целью этого протокола является определение аутофагических уровней в раке поджелудочной железы и ацинарных клетках поджелудочной железы с помощью иммунофлуоресценции LC3 и количественного определения точек LC3.
Abstract
Аутофагия представляет собой специализированный катаболический процесс, который избирательно разрушает цитоплазматические компоненты, включая белки и поврежденные органеллы. Аутофагия позволяет клеткам физиологически реагировать на стрессовые стимулы и, таким образом, поддерживать клеточный гомеостаз. Раковые клетки могут модулировать свои уровни аутофагии, чтобы адаптироваться к неблагоприятным условиям, таким как гипоксия, дефицит питательных веществ или повреждение, вызванное химиотерапией. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы является одним из самых смертоносных видов рака. Раковые клетки поджелудочной железы обладают высокой аутофагической активностью из-за транскрипционной апрегуляции и посттрансляционной активации белков аутофагии.
Здесь клеточная линия PANC-1 использовалась в качестве модели раковых клеток поджелудочной железы человека, а линия ацинарных клеток поджелудочной железы AR42J использовалась в качестве физиологической модели высокодифференцированных клеток млекопитающих. В этом исследовании в качестве индикатора состояния активации аутофагии использовали иммунофлуоресценцию связанного с микротрубочками белка легкой цепи 3 (LC3). LC3 представляет собой белок аутофагии, который в базальных условиях демонстрирует диффузный паттерн распределения в цитоплазме (известный как LC3-I в этом состоянии). Индукция аутофагии запускает конъюгацию LC3 с фосфатидилэтаноламином на поверхности новообразованных аутофагосом с образованием LC3-II, связанного с мембраной белка, который помогает в образовании и расширении аутофагосом. Для количественной оценки количества меченых автофагических структур было использовано программное обеспечение с открытым исходным кодом FIJI с помощью инструмента «3D Objects Counter».
Измерение аутофагических уровней как в физиологических условиях, так и в раковых клетках позволяет нам изучать модуляцию аутофагии при различных условиях, таких как гипоксия, химиотерапия или нокдаун определенных белков.
Introduction
Макроаутофагия (обычно называемая аутофагией) представляет собой специализированный катаболический процесс, который избирательно разрушает цитоплазматические компоненты, включая белки и поврежденные органеллы 1,2. Аутофагия позволяет клеткам физиологически реагировать на стрессовые стимулы и, таким образом, поддерживать клеточный гомеостаз3. Во время аутофагии образуется пузырь с двойной мембраной: аутофагосома. Аутофагосома содержит молекулы груза и направляет их в лизосому для деградации 1,4.
Аутофагосомы украшены легкой цепью белка 3 (LC3)5, ассоциированной с аутофагическим белком, связанным с микротрубочками. Когда аутофагия не индуцирована, LC3 диффундирует в цитоплазме и ядре в конформации LC3-I. С другой стороны, когда индуцируется аутофагия, LC3 конъюгируется с фосфатидилэтаноламином в мембране аутофагических структур6. Эта новая конформация LC3 известна как LC3-II1. Конформационный сдвиг LC3 вызывает изменения в его клеточной локализации и миграции электрофореза в додецилсульфате натрия-полиакриламидном геле (SDS-PAGE), которые могут быть обнаружены такими методами, как иммунофлуоресценция и вестерн-блоттинг 5,7. Таким образом, конъюгация LC3 является ключевым событием в аутофагическом процессе, которое может быть использовано для измерения аутофагической активности.
Ацинарная клетка поджелудочной железы является высокодифференцированной клеткой, которая в здоровых условиях имеет низкий уровень аутофагии. Однако в различных физиологических условиях или при фармакологической стимуляции они могут активировать аутофагию. Следовательно, определение аутофагических уровней в этой клеточной линии полезно для изучения потенциальных прямых или косвенных эффектов различных фармакологических или биологических агентов на аутофагию 8,9.
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы является одним из самых смертоносных видов рака, учитывая его позднюю диагностику и высокую устойчивость к химиотерапии10. Раковые клетки поджелудочной железы обладают высокой аутофагической активностью из-за транскрипционной апрегуляции и посттрансляционной активации белков, связанных с аутофагией11. Раковые клетки поджелудочной железы могут корректировать свои уровни аутофагии в ответ на неблагоприятные условия, такие как гипоксия, лишение питательных веществ или повреждение, вызванное химиотерапией11. Следовательно, анализ уровней аутофагии в раковых клетках поджелудочной железы может помочь понять, как они адаптируются к различным средам, и оценить эффективность лечения, модулирующего аутофагию.
В этом исследовании показан метод проведения иммунофлуоресценции LC3 на двух различных клеточных моделях поджелудочной железы. Первая модель, клетки PANC-1, послужили моделью для аденокарциномы протоков поджелудочной железы. Эти клетки обрабатывали гемцитабином, химиотерапевтическим агентом, который, как было показано ранее, индуцирует аутофагию, особенно в раковых клетках поджелудочной железы, несущих онкогенный ген вируса саркомы крысы Кирстен (KRAS)12,13. Вторая модель, клетки AR42J, служила более физиологической моделью экзокринных клеток поджелудочной железы. Эти клетки дифференцировались с дексаметазоном, чтобы стать более похожими на ацинарные клетки поджелудочной железы14. В этих клетках аутофагия была фармакологически индуцирована с помощью PP242, который является мощным ингибитором mTOR15. В этом исследовании мы демонстрируем применимость протокола, описанного с двумя разными моделями поджелудочной железы, и его способность различать состояния низкой и высокой аутофагии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способ, описанный в этом протоколе, позволяет визуализировать эндогенное распределение LC3 в клетке и количественно определять аутофагические уровни в различных условиях. Другой аналогичный метод, используемый для анализа распределения LC3 и определения активации аутофагии, включает м…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Университета Буэнос-Айреса (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), Национального совета по научным исследованиям и технологиям (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; и PUE 22920170100033) и Национального агентства по развитию науки и технологий (PICT 2019-01664).
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. Digesting the expanding mechanisms of autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. LC3 and autophagy. Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. Pancreatic cancer. Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. Chapter 9 – Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and measuring autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
