Summary
このプロトコルの目的は、LC3免疫蛍光およびLC3ドット定量を通じて、膵臓癌および膵臓腺房細胞のオートファジーレベルを決定することです。
Abstract
オートファジーは、タンパク質や損傷した細胞小器官などの細胞質成分を選択的に分解する特殊な異化プロセスです。オートファジーは、細胞がストレス刺激に生理学的に応答することを可能にし、したがって、細胞の恒常性を維持する。がん細胞は、オートファジーレベルを調節して、低酸素症、栄養不足、化学療法による損傷などの悪条件に適応する可能性があります。乳管膵臓腺癌は、最も致命的な種類の癌の1つです。膵臓がん細胞は、オートファジータンパク質の転写アップレギュレーションと翻訳後活性化により、高いオートファジー活性を示します。
ここでは、膵臓ヒト癌細胞のモデルとしてPANC-1細胞株を用い、高分化哺乳類細胞の生理モデルとしてAR42J膵腺房細胞株を用いた。この研究では、オートファジー活性化の状態の指標として、微小管関連タンパク質軽鎖3(LC3)の免疫蛍光を使用しました。LC3はオートファジータンパク質であり、基底条件下では細胞質内の分布の拡散パターンを示します(この状態ではLC3-Iとして知られています)。オートファジー誘導は、新しく形成されたオートファゴソームの表面上のLC3とホスファチジルエタノールアミンの結合を引き起こし、オートファゴソームの形成と増殖を助ける膜結合タンパク質であるLC3-IIを形成します。標識されたオートファジー構造の数を定量化するために、オープンソースソフトウェアFIJIが「3Dオブジェクトカウンター」ツールの助けを借りて利用されました。
生理学的条件と癌細胞の両方におけるオートファジーレベルの測定により、低酸素症、化学療法治療、または特定のタンパク質のノックダウンなどの多様な条件下でのオートファジーの調節を研究することができます。
Introduction
マクロオートファジー(一般にオートファジーと呼ばれる)は、タンパク質や損傷した細胞小器官などの細胞質成分を選択的に分解する特殊な異化プロセスです1,2。オートファジーは、細胞がストレス刺激に生理学的に応答することを可能にし、したがって、細胞の恒常性を維持する3。オートファジーの間に、二重膜小胞、すなわちオートファゴソームが形成される。オートファゴソームは貨物分子を含み、分解のためにそれらをリソソームに駆動します1,4。
オートファゴソームは、オートファジータンパク質微小管関連タンパク質軽鎖3(LC3)5によって装飾されています。オートファジーが誘導されない場合、LC3は細胞質に拡散し、核はLC3-I立体構造に拡散します。一方、オートファジーが誘導されると、LC3はオートファジー構造6の膜においてホスファチジルエタノールアミンと共役する。この新しいLC3立体配座はLC3-II1として知られています。LC3コンフォメーションシフトは、その細胞局在とドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)の移行に変化を引き起こし、免疫蛍光法やウェスタンブロットなどの手法で検出できます5,7。このように、LC3コンジュゲーションは、オートファジー活動の測定に使用できるオートファジープロセスの重要なイベントです。
膵臓腺房細胞は高度に分化した細胞であり、健康な条件下ではオートファジーの発生率が低い。しかしながら、異なる生理学的条件において、または薬理学的刺激下で、それらはオートファジーを活性化することができる。したがって、この細胞株におけるオートファジーレベルの決定は、オートファジーに対する異なる薬理学的または生物学的薬剤の潜在的な直接的または間接的な効果を研究するのに有用である8,9。
乳管膵臓腺癌は、診断が遅く、化学療法耐性が高いことを考えると、最も致命的な種類の癌の10つです。膵臓がん細胞は、オートファジー関連タンパク質の転写アップレギュレーションと翻訳後活性化により、高いオートファジー活性を示します11。膵臓がん細胞は、低酸素症、栄養不足、化学療法による損傷などの好ましくない条件に応じてオートファジーレベルを調整する可能性があります11。したがって、膵臓がん細胞のオートファジーレベルを分析することは、それらがさまざまな環境にどのように適応するかを理解し、オートファジー調節治療の有効性を評価するのに役立ちます。
この研究は、2つの異なる膵臓細胞モデルでLC3免疫蛍光を実行する方法を示しています。最初のモデルであるPANC-1細胞は、膵管腺癌のモデルとして機能しました。これらの細胞は、発癌性キルステンラット肉腫ウイルス遺伝子(KRAS)12,13を有する膵臓癌細胞において、オートファジーを誘導することが以前に示されている化学療法剤であるゲムシタビンで処理されました。第2のモデルであるAR42J細胞は、膵臓外分泌細胞のより生理学的なモデルとして役立った。これらの細胞をデキサメタゾンで分化させて、腺房膵臓細胞14により類似したものとなった。これらの細胞では、強力なmTOR阻害剤であるPP242を使用することでオートファジーが薬理学的に誘導されました15。本研究では、2つの異なる膵臓モデルで記述されたプロトコルの適用性と、低オートファジーと高オートファジーの状態を区別する能力を実証します。
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Protocol
1.細胞調製
- 12 mmの丸いカバーガラスを無水エタノールに浸し、24ウェルプレートのウェルに垂直に置きます。
- カバーを取り外し、マルチウェルプレートを紫外線に15分間さらします。
- カバーガラスを水平に置き、ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)で洗います。
- 低継代数の膵臓細胞を播種する。固定日に50%〜75%のコンフルエンシーが得られるように量を調整する必要があります16。
注:ウェルあたり2.5 ×10 4 PANC-1または4 ×10 4 AR42J細胞を播種して、3日後に細胞を固定することをお勧めします。 - 10%ウシ胎児血清、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを含むDMEMで、5%二酸化炭素(CO2)を含む加湿雰囲気下、37°Cのインキュベーター内で細胞を培養します。
注:PANC-1細胞の場合、細胞の播種と次の手順の間に2日間細胞をインキュベートすることをお勧めします。この時間の後、細胞をトランスフェクト、処理、または固定することができます。このプロトコルは、非トランスフェクションPANC-1細胞におけるゲムシタビンによる治療、ならびに非トランスフェクションAR42J細胞に対する分化およびPP242治療を例示する。
2.細胞を処理する
- PANC-1細胞に対するゲムシタビン治療
- 播種後2日目に1 μg/μLゲムシタビンをDMEM溶液で調製します。各ウェルを2.6 μLの1 μg/μLゲムシタビン溶液で処理して、20 μMの最終希釈を達成します。
- インキュベーター内で細胞を24時間インキュベートします。
- AR42J分化とPP242治療
- 4 μg/mL デキサメタゾンの DMEM 溶液を準備します。
- 各ウェルを4.9 μLの4 μg/mLデキサメタゾン溶液で処理して、100 nMの最終希釈液を得ます。
- インキュベーター内で細胞を48時間インキュベートします。
- 培地を取り出し、各ウェルを0.5 μLの1 mM PP242で処理して、1 μMの最終希釈液を得ました。
- インキュベーター内で細胞を2時間インキュベートします。
3.細胞の固定と透過処理
- 冷メタノールを含む24ウェルプレートと、冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na 2 HPO 4、2 mM KH2PO4)を含む6ウェルプレートを準備します。氷の上でそれらを維持してください。
- 各カバーガラスをピンセットで取り、PBSで2回洗浄し、メタノール中で6分間インキュベートします。
4.セルをブロックする
- 各カバーガラスをPBSで2回洗浄し、PBS(ブロッキング溶液)中の10%ウシ胎児血清中で1時間インキュベートします。
注 : この手順では、プロトコルが一時停止される場合があります。カバーガラスはブロッキング溶液中の冷蔵庫に一晩保管することができ、プロトコルは翌日も続けることができます。
5. カバーガラスと一次抗体のインキュベーション
- ブロッキング溶液に抗LC3の1:1,000溶液を調製し、氷上で維持します。
- マルチウェルの蓋の上に実験室のシーリングフィルムを置きます。
- シーリングフィルムの上に、抗LC3溶液のカバーガラスごとに1滴(25μL)を置きます。
- 各カバーガラスをピンセットで取り、細胞側が溶液に接触するように注意しながら、一次抗体ドロップの上に置きます。
- 湿った紙を平底のプラスチックの箱に入れて、湿った部屋を準備します。
- マルチウェルプレートを湿度チャンバーに入れ、ホイルで覆い、冷蔵庫で一晩インキュベートします。
6. カバーガラスと二次抗体のインキュベーション
- マルチウェルプレートを湿度チャンバーから取り外し、カバーガラスをマルチウェルプレートに戻します。
- PBSで3回洗浄します。
- ブロッキング溶液中で1:800に希釈した蛍光標識抗ウサギの溶液を調製し、光から保護された氷上で維持する。
- マルチウェル蓋の上にシーリングフィルム片を置きます。
- 抗ウサギ溶液のカバーガラスごとに一滴(25μL)をシーリングフィルムの上に置きます。
- 各カバーガラスをピンセットで取り、細胞側が溶液に接触するように注意しながら、一次抗体ドロップの上に置きます。
- マルチウェルプレートを湿度チャンバー内で、光から保護された室温(RT)で2時間インキュベートします。
7. 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)による細胞の染色
- マルチウェルプレートを湿度チャンバーから取り外し、カバーガラスをマルチウェルプレートに戻します。
- PBSで3回洗浄します。
- PBS(光から保護されている)中のDAPIの300 nM溶液を調製します。
- 各カバーガラスをDAPI溶液で10分間インキュベートします。
- PBSで3回洗浄します。マルチウェルプレートを光から保護してください。
8.モンタージュ
- 水と一枚の紙で2つのビーカーを準備します。
- ポリビニルアルコール-ビス(トリメチルアルミニウム)-1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン付加物(PVA-DABCO)溶液のカバーガラス1枚につき1滴(10 μL)をスライドに置きます。
注:PVA-DABCOは、0.25 M DABCO、10% W/V PVA、20% グリセロール、および 50% トリス塩酸塩 (1.5 M、pH 8.8) を超純水中で組み合わせて調製されます。 - ピンセットで各カバーガラスを取り、各ウォータービーカーで洗い、紙で乾かし、PVA-DABCOドロップの上に置きます(セルを溶液と接触させます)。
- 光から保護して一晩乾かします。
9. 共焦点顕微鏡観察と画像キャプチャ
- 倒立共焦点顕微鏡でカバーガラスを約63x17の対物レンズで可視化します。
- 標識された細胞の代表的な画像をキャプチャします。
10. LC3ドットの定量化
- キャプチャしたチャンネルを含む各画像ファイル(「.czi」など)をImageJ(FIJI)画面にドラッグ&ドロップして開きます。ダイアログ ボックスで [OK ] をクリックし、[ コンソール ] ウィンドウを閉じます。
- 「画像」タブで、「カラー>分割チャンネル」を選択します。
- LC3画像以外のチャンネルに対応する画像を閉じます。
- [画像]タブから、[>カラーバランスの調整]を選択します
- 画像が飽和するまで [ 最大 ] スライダーを左に動かして、セルの輪郭を視覚化します。
- フリーハンド選択ツールでセルのアウトラインを描画します。
- [リセット]ボタンをクリックして、色調整をリセットします。
- [編集] タブで、[切り取り] を選択して、選択した項目を切り取ります。
- 画像を保存せずに閉じます。
- [ 編集 ] タブで、[ 貼り付け] を選択します。
- [ 分析] メニューで、ツール[ 3Dオブジェクトカウンター]を選択します。
- しきい値を設定します。この調査で提供される例では、しきい値は 2,000 に設定されています。
- サイズ フィルターを設定します。この研究では、50から500の間に設定されています。
- [オブジェクト] ボックスと [概要] ボックスにマークが付いていることを確認します。
- OKをクリックします。ドットの数は、概要で検出されたオブジェクトとして説明されます。
図1:LC3免疫蛍光プロトコルの概略図。LC3免疫蛍光法のために提供される一般的なプロトコールを表す概略図。BioRender.com で作成された図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
このプロトコルは、膵臓細胞株におけるLC3の免疫蛍光を行い、異なる条件下でのオートファジーレベルを決定する。この実験の結果は、LC3とDAPIに対応する赤と青のチャネルからの細胞画像の観察でした。LC3画像はこのタンパク質の細胞分布を示し、DAPIは核局在を示しています。 図2A は、基礎またはゲムシタビン処理条件下でのPANC-1細胞におけるLC3およびそのDAPI染色との融合の免疫蛍光の代表的な画像を示す。LC3染色の一連の画像を、フィジーの ツール3Dオブジェクトカウンター を使用して分析しました。このソフトウェアを用いて、細胞当たりのLC3ドットの量を定量した。 図2B の棒グラフは、基礎対ゲムシタビン処理条件下でのPANC-1細胞におけるLC3ドット定量の結果を示す。このグラフでは、LC3ドットはゲムシタビン処理下で有意に増加し、LC3ドットの数はオートファジー活性を直接示しています。また、ゲムシタビンが膵臓がん細胞のオートファジーを引き起こすことも以前に示しました12。全体として、この記事で提示された方法は、これらの細胞におけるゲムシタビンによって誘導されるオートファジー活性化の増加のレベルの検出を可能にする。
このプロトコルは、LC3免疫蛍光法を使用して膵臓がん細胞のオートファジー活性を測定することに焦点を当てていますが、より生理学的に関連するモデルを含む他の細胞株にも適用できる可能性があります。生理学的応答の評価における本方法の有効性を試験するために、AR42J細胞株を使用した。これらの細胞はラット外分泌膵臓腫瘍に由来しますが、糖質コルチコイド刺激で外分泌細胞に分化させることができるため、適切な膵臓モデルになります8,14,18。AR42J細胞を100nMデキサメタゾン処理で48時間分化させ、続いてmTOR阻害剤PP242で処理してオートファジーを誘導した15。得られた結果を図3に提示し、PP242処理下での細胞当たりのLC3ドット数の有意な増加を示す。
これまでに、提示された方法が癌細胞とより生理学的なモデルの両方におけるオートファジー活性を評価するのに有効であることを実証しました。ただし、提示されたプロトコルからのわずかな逸脱は、解釈できない結果をもたらす可能性があることに注意することが重要です。
図4A は、カバーガラスに播種された細胞が多すぎて、過剰なコンフルエントが得られた、最適ではない実験からの代表的な画像を示しています。この種の実験は、さまざまな理由で解釈できない可能性があります。第一に、この研究で言及されている細胞型は、細胞が腺房にグループ化されている外分泌膵臓に由来します。過度のコンフルエントの下では、これらの細胞は積み重なり、互いに重なり合う傾向があります( 図4Aのセル1とセル2など、セル3とセル4の上にあります)。この現象により、LC3ドットがどのセルに属しているかを知ることが事実上不可能になり、セルあたりのドット数を推定することは非常に困難になります。一方、コンフルエント性の高い細胞はストレスを受ける傾向があり、オートファジーを引き起こします。その結果、バックグラウンドオートファジー活性の増加により、コントロール細胞と処理細胞の間のオートファジーレベルの差が減少する可能性があります。
図4Bでは、細胞をメタノールの代わりにパラホルムアルデヒドで固定した別の種類の次善実験からの代表的な画像が示されています。この固定法は、一般的にさまざまなタンパク質の保存に効果的ですが、結果として得られる画像はその真の分布を正確に反映していないため、LC3には適していません。この技術的な間違いにより、低いオートファジーレベルと高いオートファジーレベルの違いを見つけることが不可能になる可能性があります。
一般に、細胞株は、播種の1日後に処理、トランスフェクト、または固定することができます。それにもかかわらず、PANC-1細胞の場合、実験の後続のステップに進む前に、細胞がガラスカバーガラスに完全に付着することを確実にするために播種後2日間待つ必要があることに言及することは重要である。 図4C は、播種後わずか1日目に細胞をゲムシタビンで処理した実験からの代表的な画像を示す。図から、この実験の細胞は丸い形をしていたことが観察できます。この形態は細胞質と核の関係を減少させ、LC3の細胞内分布の理解やオートファジーレベルの低値と高値の判別を困難にしました。AR42Jにはこの問題がなく、播種の翌日に処理または固定する準備ができていることに注意することが重要です。
別の次善の結果は、メタノール固定の時間を変化させた場合に得ることができる。固定時間が短いと、細胞を3分間固定した 図4Dに示すように、不完全な固定が発生する可能性があります。不完全な固定は、適切なLC3免疫標識を妨げ、画像が不鮮明になり、定量が最適ではなくなる可能性があります。
図2:基底またはゲムシタビン条件下でのPANC-1細胞におけるLC3免疫蛍光およびLC3ドット定量。 PANC-1細胞を20 μMゲムシタビンで24時間処理するか、未処理のままにして抗LC3で免疫標識しました。(A)各条件の代表的な画像を示す。スケールバー:10μm。 (B)棒グラフは、各条件のセルあたりのLC3ドットの平均と平均の標準誤差(SEM)を表します。N = 3つの独立した実験からの条件あたり10個の細胞。 p < 0.001 スチューデントのt検定による。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:基礎またはPP242条件下でのAR42J細胞におけるLC3免疫蛍光およびLC3ドット定量。 AR42J細胞を100 nMデキサメタゾンで48時間分化させた後、1 μM PP242で2時間処理するか、未処理のまま放置した後、抗LC3で免疫標識しました。(A)各条件の代表的な画像を示す。スケールバー:10μm。 (B)棒グラフは、各条件のセルあたりのLC3ドットの平均と平均の標準誤差(SEM)を表します。N = 3つの独立した実験からの条件あたり10個の細胞。** p < 0.01 スチューデントのt検定による。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:次善の実験。 次善の実験におけるLC3免疫蛍光の代表的な画像が示されています。スケールバー:10μm。 (A)過剰コンフルエント:7×104 個のPANC-1細胞を播種し、ゲムシタビンで処理し、抗LC3で免疫標識した。セル 1 とセル 2 がセル 3 とセル 4 より上にあることを示すために、4 つのセルがマークされます。(B)PFA固定:PANC-1細胞をゲムシタビンで処理し、PFAで固定し、抗LC3で免疫標識した。(C)不完全な伸展:播種の翌日にPANC-1細胞をゲムシタビンで処理し、抗LC3で免疫標識した。(D)不完全な固定:PANC-1細胞をゲムシタビンで処理し、メタノールで3分間固定し、抗LC3で免疫標識した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルに記載されている方法は、細胞内の内因性LC3分布を視覚化し、異なる条件下でオートファジーレベルを定量化することを可能にする。LC3の分布を分析し、オートファジーの活性化を決定するために使用される別の同様の方法には、蛍光標識されたLC3トランスフェクション(RFP-LC3など)が含まれます19。RFP-LC3トランスフェクションには、固定が不要(この方法をライブセルイメージングに適用できる20)、安価で、LC3抗体の反応性に依存しないという利点があります。一方、LC3の免疫蛍光は、内因性LC3の画像を提供するという利点があり、オートファジー21に依存しないタンパク質凝集体の形成など、LC3の過剰発現に関連する可能性のある問題を回避します。さらに、この方法は細胞のトランスフェクションの容易さに依存しないため、多様な細胞株に適用できます。ただし、使用するLC3抗体とその反応性によっては、機能しない細胞株もあります。一部の抗体は、理論的には異なる種と適合性がある場合でも、特定の種ではうまく機能しない可能性があります。このプロトコルで使用された抗体(LC3B D11)の場合、ヒト細胞(PANC-1、HEK293T、HeLa)およびラット細胞(AR42J)に対して完全に機能することがわかりました。しかし、マウス細胞(MEF細胞)では、非特異的核染色が観察されたため、効果はありません。LC3スポットの定量は、内因性であろうと過剰発現であろうと、LC3-IIの産生増加を示す可能性のあるオートファジー活性化の変化と、オートファジーフラックス状態を示す可能性のあるLC3-II分解の変化を区別する上で限界があることは注目に値します。オートファジー活性を包括的に評価するために、追加の方法を使用することができます。例えば、RFP-GFP-LC3発現の使用は、リソソーム22,23の内側または外側のLC3-IIを区別することによって正確な評価を提供することができる。
図4に示すように、プロトコルには、変更が最適ではない結果につながる可能性があるため、変更してはならない重要なステップがいくつかあります。まず、播種する細胞の数を正しく設定することが重要です。十分な数の細胞が播種されていない場合、それらはトランスフェクションまたは処理に抵抗せず、丸みを帯びたままになる傾向があります。逆に、細胞が過剰に播種されると、隣接する細胞の上に成長する傾向があり、個々の細胞に焦点を合わせてLC3ドットを区別することが困難になります。特に、図4Aに示されているように細胞が近接しているが重なり合っていない状況では、EGFRなどの特定の膜マーカーによる免疫染色を使用して、各細胞24に属する陽性マーカーを区別することが有用であり得る。ただし、E-カドヘリンやEpCAMなどの特定のマーカーは、この細胞型に関連する典型的な上皮間葉移行プロセスに起因する膜発現の低下により、PANC-1細胞ではこの目的に適していないことに注意することが重要です25,26,27。第二に、PANC-1細胞を特異的に扱う場合、播種と実験の後続のステップの間に少なくとも1日待つことが不可欠です。逆に、適切な時間を待たないと、セルが丸められ、結果の解釈が困難になる可能性があります。第三に、固定はこのプロトコルの重要なステップです。これまでに示したように、この方法は適切なメタノール固定でのみ機能します。パラホルムアルデヒドの固定はLC3イムノラベリングでは正しく機能しませんが、メタノールの固定時間は、より短い時間が不完全な固定につながる可能性があるため、変更しないでください。メタノールの固定時間を1時間まで試験したところ、LC3標識に差は認められなかった。それにもかかわらず、メタノール固定は可溶性細胞タンパク質および遊離蛍光分子の損失につながる可能性があるため、長時間の固定時間の使用はお勧めしません28。したがって、正確で信頼性の高い結果を確保するために、標準の固定時間に従うことをお勧めします。
説明されているプロトコルでは、いくつかの変更が受け入れられる場合があります。例えば、24ウェルプレートの代わりに12ウェルプレートを使用でき、12mmカバースリップの代わりに15mmの丸いカバースリップ上で細胞を成長させることができます。この場合、播種される細胞の数、および使用される試薬の量は、このプロトコルに記載されているものよりも多くなると考えるべきです。この場合、4 × 104 PANC-1と6.5 ×10 4 AR42Jをシードする必要があります。さらに、使用済みのブロッキングソリューションは、PBSの1%BSAなどの他のソリューションに置き換えることができ、これにより同様の結果が得られます。同様に、結果を大幅に変更することなく、ブロッキング時間を最大24時間まで増やすことができます。抗体のインキュベーション時間と濃度は調整でき、たとえば別のLC3抗体が使用されている場合は変更できます。PVA-DABCO溶液はこの研究で調製されるが、市販のモンタージュ溶液も使用することができる。一方、定量方法は変更可能である。たとえば、画像にいくつかのフィルターまたはマスクを適用することが可能であり、ドット定量化に代替ツールを使用できます。
この研究では、LC3の免疫蛍光法を膵臓がん細胞の挙動を研究するために応用することを指示しました。これらの細胞では、オートファジーは基本的に活性化され、化学療法、低酸素症、栄養不足などの多様なストレスの多い状況への応答として調節される可能性があります11,12。これらの細胞におけるオートファジーの決定は、化学療法、放射線療法、またはオートファジーを調節する他の治療に対する細胞応答の研究に適用できる可能性があります。図3に示すように、提示された方法は生理学的モデルに適用することができる。本研究では、オートファジーレベルの定量化に焦点を当てましたが、LC3の免疫蛍光は、LC3と多様なタンパク質との間の共局在の評価も可能にする可能性があります。例えば、オートファジープロセスのさまざまなポイントでタンパク質をマークし、LC3との共局在が何らかの処理または一部のタンパク質のダウンレギュレーションによって影響を受けるかどうかを評価するための機構的アプローチとして役立ちます。このようにして、例えば、何らかのオートファジー阻害剤がLC3結合の前後にオートファジーフラックスを中断するかどうかを決定することができた。最後に、この方法は、動物モデルまたはヒト生検サンプルにおけるオートファジー活性化を決定するために組織サンプルに適合させることもできる。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
この研究は、ブエノスアイレス大学(UBACyT 2018-2020 20020170100082BA)、国立科学研究技術評議会(CONICET)(PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO;およびPUE 22920170100033)、および国立科学技術振興庁(PICT 2019-01664)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
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