Evaluering av autofaginivåer i to forskjellige bukspyttkjertelcellemodeller ved bruk av LC3-immunfluorescens
Summary
Målet med denne protokollen er å bestemme autofagiske nivåer i kreft i bukspyttkjertelen og akinarceller i bukspyttkjertelen gjennom LC3-immunfluorescens og LC3-punktkvantifisering.
Abstract
Autofagi er en spesialisert katabolsk prosess som selektivt nedbryter cytoplasmatiske komponenter, inkludert proteiner og skadede organeller. Autofagi gjør det mulig for celler å fysiologisk reagere på stressstimuli og dermed opprettholde cellulær homeostase. Kreftceller kan modulere autofaginivåene sine for å tilpasse seg ugunstige tilstander som hypoksi, næringsmangel eller skade forårsaket av kjemoterapi. Ductal pankreas adenokarsinom er en av de dødeligste typer kreft. Kreftceller i bukspyttkjertelen har høy autofagiaktivitet på grunn av transkripsjonell oppregulering og posttranslasjonell aktivering av autofagiproteiner.
Her ble PANC-1-cellelinjen brukt som en modell av kreftceller i bukspyttkjertelen, og AR42J pankreatisk acinarcelle cellelinje ble brukt som en fysiologisk modell av høyt differensierte pattedyrceller. Denne studien brukte immunfluorescens av mikrotubuli-assosiert proteinlyskjede 3 (LC3) som en indikator på status for autofagiaktivering. LC3 er et autofagiprotein som i basalforhold viser et diffust distribusjonsmønster i cytoplasma (kjent som LC3-I i denne tilstanden). Autofagi-induksjon utløser konjugering av LC3 til fosfatidyletanolamin på overflaten av nydannede autofagosomer for å danne LC3-II, et membranbundet protein som hjelper til med dannelse og utvidelse av autofagosomer. For å kvantifisere antall merkede autofagiske strukturer ble åpen kildekode-programvaren FIJI brukt ved hjelp av verktøyet “3D Objects Counter”.
Målingen av autofagiske nivåer både i fysiologiske forhold og i kreftceller tillater oss å studere modulering av autofagi under ulike forhold som hypoksi, kjemoterapibehandling eller knockdown av visse proteiner.
Introduction
Makroautofagi (ofte referert til som autofagi) er en spesialisert katabolsk prosess som selektivt nedbryter cytoplasmatiske komponenter, inkludert proteiner og skadede organeller 1,2. Autofagi gjør det mulig for celler å fysiologisk reagere på stressstimuli og dermed opprettholde cellulær homeostase3. Under autofagi dannes en dobbel membranvesikkel: autofagosomet. Autofagosomet inneholder lastmolekylene og driver dem til lysosomet for nedbrytning 1,4.
Autofagosomer er dekorert av den autofagiske proteinmikrotubuli-assosierte proteinlyskjeden 3 (LC3)5. Når autofagi ikke induseres, diffunderes LC3 i cytoplasma og kjernen i LC3-I-konformasjonen. På den annen side, når autofagi induseres, konjugeres LC3 med et fosfatidyletanolamin i membranen til de autofagiske strukturer6. Denne nye LC3-konformasjonen er kjent som LC3-II1. LC3-konformasjonsskiftet forårsaker endringer i cellulær lokalisering og dets dodecylnatriumsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) migrasjon, som kan detekteres ved teknikker som immunfluorescens og vestlig blot 5,7. På denne måten er LC3-konjugering en nøkkelhendelse i autofagisk prosess som kan brukes til å måle autofagisk aktivitet.
Acinarcellen i bukspyttkjertelen er en svært differensiert celle som under sunne forhold har lav autofagi. Men under forskjellige fysiologiske forhold eller under farmakologisk stimulering kan de aktivere autofagi. Derfor er bestemmelsen av autofagiske nivåer i denne cellelinjen nyttig for å studere potensielle direkte eller indirekte effekter av forskjellige farmakologiske eller biologiske agenser på autofagi 8,9.
Duktalt adenokarsinom i bukspyttkjertelen er en av de dødeligste krefttypene, gitt sin sene diagnose og dens høye kjemoterapiresistens10. Kreftceller i bukspyttkjertelen har høy autofagiaktivitet på grunn av transkripsjonell oppregulering og posttranslasjonell aktivering av autofagirelaterte proteiner11. Kreftceller i bukspyttkjertelen kan justere autofaginivåene sine som respons på ugunstige forhold som hypoksi, næringsmangel eller kjemoterapi-indusert skade11. Derfor kan analyse av autofaginivåene i kreftceller i bukspyttkjertelen bidra til å forstå hvordan de tilpasser seg varierende miljøer og evaluere effektiviteten av autofagimodulerende behandlinger.
Denne studien viser en metode for å utføre LC3-immunfluorescens i to forskjellige pankreascellulære modeller. Den første modellen, PANC-1-celler, fungerte som en modell for bukspyttkjertelduktalt adenokarsinom. Disse cellene ble behandlet med gemcitabin, et kjemoterapimiddel som tidligere har vist seg å indusere autofagi, spesielt i kreftceller i bukspyttkjertelen som bærer det onkogene Kirsten-rottesarkomvirusgenet (KRAS)12,13. Den andre modellen, AR42J-celler, fungerte som en mer fysiologisk modell av eksokrine bukspyttkjertelceller. Disse cellene ble differensiert med deksametason for å bli mer lik acinare pankreasceller14. I disse cellene ble autofagi farmakologisk indusert ved bruk av PP242, som er en potent mTOR-hemmer15. I denne studien demonstrerer vi anvendeligheten av protokollen beskrevet med to forskjellige bukspyttkjertelmodeller og dens evne til å diskriminere mellom tilstander med lav og høy autofagi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet i denne protokollen gjør det mulig å visualisere den endogene LC3-fordelingen i cellen og kvantifisere de autofagiske nivåene under forskjellige forhold. En annen lignende metode som brukes til å analysere LC3-fordelingen og bestemme autofagiaktivering, involverer fluorescensmerket LC3-transfeksjon (som RFP-LC3)19. RFP-LC3-transfeksjon har fordelene ved ikke å trenge fiksering (som gjør det mulig å anvende denne metoden i levende celleavbildning20),…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Universitetet i Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), Nasjonalt råd for vitenskapelig forskning og teknologi (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; og PUE 22920170100033) og National Agency for Scientific and Technological Promotion (PICT 2019-01664).
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. Digesting the expanding mechanisms of autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. LC3 and autophagy. Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. Pancreatic cancer. Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. Chapter 9 – Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and measuring autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
