Evaluatie van autofagieniveaus in twee verschillende pancreascelmodellen met behulp van LC3-immunofluorescentie
Summary
Het doel van dit protocol is om autofagische niveaus in alvleesklierkanker en pancreasacinaire cellen te bepalen door middel van LC3-immunofluorescentie en LC3-puntkwantificering.
Abstract
Autofagie is een gespecialiseerd katabolisch proces dat selectief cytoplasmatische componenten afbreekt, waaronder eiwitten en beschadigde organellen. Autofagie stelt cellen in staat om fysiologisch te reageren op stressprikkels en zo cellulaire homeostase te behouden. Kankercellen kunnen hun autofagieniveaus moduleren om zich aan te passen aan ongunstige omstandigheden zoals hypoxie, tekort aan voedingsstoffen of schade veroorzaakt door chemotherapie. Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier is een van de dodelijkste vormen van kanker. Alvleesklierkankercellen hebben een hoge autofagie-activiteit als gevolg van de transcriptionele upregulatie en posttranslationele activering van autofagie-eiwitten.
Hier werd de PANC-1-cellijn gebruikt als een model van menselijke kankercellen van de alvleesklier en de AR42J pancreas-acinaire cellijn werd gebruikt als een fysiologisch model van sterk gedifferentieerde zoogdiercellen. Deze studie gebruikte de immunofluorescentie van microtubule-geassocieerde eiwit lichtketen 3 (LC3) als een indicator van de status van autofagie-activering. LC3 is een autofagie-eiwit dat in basale omstandigheden een diffuus distributiepatroon vertoont in het cytoplasma (bekend als LC3-I in deze aandoening). Autofagie-inductie activeert de conjugatie van LC3 tot fosfatidylethanolamine op het oppervlak van nieuw gevormde autofagosomen om LC3-II te vormen, een membraangebonden eiwit dat helpt bij de vorming en uitbreiding van autofagosomen. Om het aantal gelabelde autofagische structuren te kwantificeren, werd de open-source software FIJI gebruikt met behulp van de “3D Objects Counter” -tool.
De meting van de autofagische niveaus, zowel in fysiologische omstandigheden als in kankercellen, stelt ons in staat om de modulatie van autofagie te bestuderen onder verschillende omstandigheden zoals hypoxie, chemotherapiebehandeling of de knockdown van bepaalde eiwitten.
Introduction
Macroautofagie (gewoonlijk autofagie genoemd) is een gespecialiseerd katabolisch proces dat selectief cytoplasmatische componenten afbreekt, waaronder eiwitten en beschadigde organellen 1,2. Autofagie stelt cellen in staat om fysiologisch te reageren op stressprikkels en zo cellulaire homeostase3 te behouden. Tijdens autofagie wordt een dubbel membraanblaasje gevormd: het autofagosoom. Het autofagosoom bevat de ladingmoleculen en drijft ze naar het lysosoom voor afbraak 1,4.
Autofagosomen worden versierd door het autofagische eiwit microtubule-geassocieerde eiwit lichtketen 3 (LC3)5. Wanneer autofagie niet wordt geïnduceerd, wordt LC3 diffuus in het cytoplasma en de kern in de LC3-I-conformatie. Aan de andere kant, wanneer autofagie wordt geïnduceerd, wordt LC3 geconjugeerd met een fosfatidylethanolamine in het membraan van de autofagische structuren6. Deze nieuwe LC3-conformatie staat bekend als LC3-II1. De LC3-conformatieverschuiving veroorzaakt veranderingen in de cellulaire lokalisatie en de migratie van dodecylnatriumsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), die kan worden gedetecteerd door technieken zoals immunofluorescentie en western blot 5,7. Op deze manier is LC3-conjugatie een belangrijke gebeurtenis in het autofagische proces die kan worden gebruikt om autofagische activiteit te meten.
De pancreasacinaire cel is een sterk gedifferentieerde cel die, onder gezonde omstandigheden, een lage mate van autofagie heeft. In verschillende fysiologische omstandigheden of onder farmacologische stimulatie kunnen ze echter autofagie activeren. Daarom is de bepaling van autofagische niveaus in deze cellijn nuttig voor het bestuderen van de potentiële directe of indirecte effecten van verschillende farmacologische of biologische agentia op autofagie 8,9.
Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier is een van de dodelijkste vormen van kanker, gezien de late diagnose en de hoge chemotherapieresistentie10. Alvleesklierkankercellen hebben een hoge autofagie-activiteit als gevolg van de transcriptionele upregulatie en posttranslationele activering van autofagie-gerelateerde eiwitten11. Alvleesklierkankercellen kunnen hun autofagieniveaus aanpassen als reactie op ongunstige omstandigheden zoals hypoxie, tekort aan voedingsstoffen of door chemotherapie veroorzaakte schade11. Daarom kan het analyseren van de autofagieniveaus in alvleesklierkankercellen helpen begrijpen hoe ze zich aanpassen aan verschillende omgevingen en de effectiviteit van autofagiemodulerende behandelingen evalueren.
Deze studie toont een methode om LC3-immunofluorescentie uit te voeren in twee verschillende pancreascellulaire modellen. Het eerste model, PANC-1-cellen, diende als model voor ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier. Deze cellen werden behandeld met gemcitabine, een chemotherapeuticum waarvan eerder is aangetoond dat het autofagie induceert, met name in alvleesklierkankercellen die het oncogene Kirsten rat sarcoma virus-gen (KRAS)12,13 dragen. Het tweede model, AR42J-cellen, diende als een meer fysiologisch model van exocriene pancreascellen. Deze cellen werden gedifferentieerd met dexamethason om meer op acinaire pancreascellen te gaan lijken14. In deze cellen werd autofagie farmacologisch geïnduceerd door het gebruik van PP242, een krachtige mTOR-remmer15. In deze studie tonen we de toepasbaarheid aan van het protocol beschreven met twee verschillende pancreasmodellen en het vermogen om onderscheid te maken tussen toestanden van lage en hoge autofagie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode die in dit protocol wordt beschreven, maakt het mogelijk om de endogene LC3-verdeling in de cel te visualiseren en de autofagische niveaus onder verschillende omstandigheden te kwantificeren. Een andere vergelijkbare methode die wordt gebruikt om de LC3-verdeling te analyseren en autofagie-activering te bepalen, omvat fluorescentie-gelabelde LC3-transfectie (zoals RFP-LC3)19. RFP-LC3-transfectie heeft de voordelen dat er geen fixatie nodig is (waardoor deze methode kan worden toegepast …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Universiteit van Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), de Nationale Raad voor Wetenschappelijk Onderzoek en Technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; en PUE 22920170100033) en het Nationaal Agentschap voor Wetenschappelijke en Technologische Promotie (PICT 2019-01664).
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. Digesting the expanding mechanisms of autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. LC3 and autophagy. Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. Pancreatic cancer. Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. Chapter 9 – Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and measuring autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
